婴幼儿食品源阪崎克罗诺杆菌的3种分型方法

阪崎克罗诺杆菌污染婴幼儿食品可能导致新生儿和婴幼儿脑膜炎、败血症和坏死性小肠结肠炎,对其健康造成严重威胁。采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)、多位点序列分型(MLST)和肠杆菌间保守重复序列PCR(ERIC-PCR)对分离于婴幼儿配方乳粉、米粉和辅食中的阪崎克罗诺杆菌进行分子分型,计算3种分型方法的辛普森多样性指数(DI)值,评价3种方法的分型效率,以便精确和快速开展阪崎克罗诺杆菌流行病学研究。PFGE、MLST和ERIC-PCR可分别将37株阪崎克罗诺杆菌分为35个PFGE基因型、28个ERIC-PCR型和23个序列(ST)型,分型结果的DI值分别为99.55%,96.40%和98.05%。3种方法对阪崎克罗诺杆菌均具有较高的分型能力,其中PFEG分型能力最高,分型效率最佳。     

基于MMR缺陷的高频突变食源性沙门氏菌环丙沙星耐药机制

目的：通过研究甲基导向错配修复系统（methyl-directed mismatch repair,MMR）主要调控基因缺陷对食源性沙门氏菌高频突变子突变频率和环丙沙星药敏性的影响,揭示其调控机制。方法：采用萘啶酮酸和利福平平板测定90 株食源性沙门氏菌高频突变子的突变频率;聚合酶链式反应结合DNA测序法检测耐药基因突变;琼脂稀释法测定环丙沙星对沙门氏菌高频突变子的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）,确定MMR缺陷与沙门氏菌高频突变子突变频率、MIC及耐药基因间的关系;通过电转化法将野生mutS、mutH、mutL和uvrD基因分别转入高频突变子103D2,采用实时聚合酶链式反应法测定野生型基因转入前后103D2耐药相关基因表达差异,分析MMR基因缺陷对沙门氏菌高频突变子环丙沙星耐药性的影响及调控机制。结果：90 株沙门氏菌高频突变子中共有89 株对环丙沙星耐药,49 株MutS编码基因发生突变（MutS－）,且相较于MutS非突变株,在MutS突变株中GyrA（67.3%）及ParC（87.8%）蛋白突变检出率更高。103D2转入野生型mutS、mutH、mutL 及uvrD基因质粒后,103D2:P-mutS突变频率显著下降,103D2:P-mutL和103D2:P-uvrD突变频率极显著下降。4 株互补菌株中marA基因显著下调,marR、tolC（除103D2:P-uvrD外）基因上调,降低103D2对环丙沙星耐药性。结论：MMR缺陷可通过影响外排泵和膜编码基因marA、marR和tolC的表达改变对沙门氏菌高频突变子的耐药性及突变频率产生影响。     

沙门菌传代中(氟)喹诺酮类抗生素筛选株药敏性及相关基因突变和表达

目的研究在不同浓度(氟)喹诺酮类抗生素存在条件下,沙门菌在传代时得到的筛选株中与耐药性相关部分基因的变异和表达水平变化规律及其与耐药性间的关联性。方法使用含有一定浓度(氟)喹诺酮类抗生素的肉汤培养基对沙门菌进行培养,在含有相同浓度同类抗生素的平板上划线筛选突变株,微量肉汤稀释法测定筛选株的药敏性,聚合酶链式反应(PCR)结合DNA测序确定喹诺酮耐药决定区(quinolone resistance-determining region,QRDR)基因突变,实时荧光定量PCR(real-time qPCR)法检测外排泵AcrAB-TolC编码基因表达水平。结果沙门菌(ATCC 14028s)在含有不同代、不同浓度(氟)喹诺酮类抗生素的LB培养基中培养、筛选后,筛选株对抗生素耐受性均有不同程度增加。萘啶酮酸第5～7代筛选株gyrA突变,发生Asp87Tyr变异;环丙沙星第4～7代筛选株gyrA突变,发生Asp87Asn变异;加替沙星、左氧氟沙星和德拉沙星第1～7代筛选株gyrA中均未检出核苷酸突变。随着抗生素浓度增加,各抗生素相应筛选株中外排泵AcrAB-TolC编码基因表达水平较原始菌株增加,差异有统计学意义(P0.05),第7代菌株acrAB-tolC表达量间差异无统计学意义(P0.05)。(氟)喹诺酮类抗生素对不同代筛选株的最小抑菌浓度(MIC)与其对沙门菌(ATCC 14028s)的MIC值比值、gyrA突变、acrAB-tolC表达水平与抗生素作用浓度和筛选代数间呈正相关。结论在(氟)喹诺酮类抗生素作用下,沙门菌可通过QRDR基因突变及增加acrAB-tolC表达适应抗生素胁迫环境;新一代(氟)喹诺酮类抗生素作用于沙门菌时,菌株QRDR靶位点突变概率降低;多次重复作用后,菌株acrAB-tolC表达量虽然增加,但表达量间差异无统计学意义(P0.05),避免了因突变导致耐药性的进一步增强。     

适于制备参考菌株用沙门氏菌的鉴定和特性研究

目的:对分离自陕西、广东、福建、上海、北京、河南和四川等7省(市)的118株沙门氏菌进行染色镜检、生化和16S rDNA鉴定,β-内酰胺酶编码基因遗传稳定性和药敏性测定,为制备适于携带β-内酰胺酶类编码基因食源性致病菌检测用参考菌株奠定材料基础。方法:采用革兰氏染色、VITEK生化鉴定、MALDI-TOF-MS鉴定、16S rDNA基因扩增和序列测定分析鉴定菌株;采用临床和实验室标准协会推荐的琼脂稀释法测定沙门氏菌的药敏性;采用传代培养、PCR扩增、基因序列测定和基因库在线比对方法,确定沙门氏菌携带的与β-内酰胺类抗生素耐药相关编码基因的遗传稳定性。结果:118株沙门氏菌的生化特性、16S rDNA、MALDI-TOF-MS鉴定结果均符合沙门氏菌属的典型特征。菌株对氨苄西林、磺胺异噁唑和头孢噻呋(100.00%)耐药最为普遍,对四环素和萘啶酮酸等7种抗生素的耐药率菌均在50%以上。76株(64.41%)菌株携带bla_(TEM-1),其次分别为bla_(CTX-M-55)(60,50.85%)、bla_(OXA-1)(19,16.10%)、bla_(CTX-M-3)(18,15.25%)、bla_(CTX-M-15)(2,1.69%)、bla_(TEM-116)(2,1.69%)、bla_(CTX-M-123)(1,0.85%)和bla_(CTX-M-64)(1,0.85%)。筛选出的12株沙门氏菌,其携带的相关编码基因在传代过程均未丢失或发生突变。结论:4种方法对118株沙门氏菌的鉴定结果均与沙门氏菌属的特性吻合,12株代表性沙门氏菌携带的bla_(TEM-1)、bla_(CTX-M)和bla_(OXA-1)基因可在15代传代过程稳定遗传,具有制备β-内酰胺类抗生素耐药性编码基因检测用参考菌株的潜能。