降糖肽Aglycin的高效表达及活性鉴定

基于自组装肽ELK16能在大肠杆菌细胞内自聚集的特性,本研究将Aglycin通过一个内含肽Mxe GyrA与自组装肽连接,构建能在体外自剪切的重组表达载体pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16。将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行蛋白表达条件的优化,得到目的蛋白聚集体,随后对聚集体进行DTT切割条件的优化,经过进一步纯化最终可得到纯度为98.15%、产量为5.53mg/g菌体湿重的Aglycin肽。采用基因工程手段重组表达Aglycin的产量比目前化学提取方法提高了近100倍。此外,经体外实验证明,Aglycin对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50(36.48μmol/L)比阿卡波糖(991.33μmol/L)低,说明Aglycin比阿卡波糖有更强的α-葡萄糖苷酶抑制活性,这进一步证明Aglycin有开发为α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜力。     

降糖多肽Brevinin-2GUb的高效表达及活性鉴定

为实现降糖多肽Brevinin-2GUb在大肠杆菌中的高效表达,本文将Brevinin-2GUb基因插入到含有硫氧还蛋白、His标签及肠激酶酶切位点的p ET32a载体中,将重组表达载体p ET32a-Trx-His-EK-Brevinin-2GUb转化至大肠杆菌中诱导表达Trx-His-EK-Brevinin-2GUb融合蛋白。通过对表达温度进行优化,结果显示16℃诱导表达20 h后融合蛋白产量达到36 mg/L;该融合蛋白经肠激酶(EK)特异性切割后成功获得不带标签的Brevinin-2GUb多肽,产量约为2.50 mg/L,纯度达90%以上。通过反相高效液相色谱对重组表达的Brevinin-2GUb进行鉴定,结果显示重组表达的Brevinin-2GUb与人工合成的Brevinin-2GUb的氨基酸序列一致。通过血平板检测发现,170μg/m L的重组表达Brevinin-2GUb多肽无溶血效应。此外,重组表达的Brevinin-2GUb多肽在浓度为10μg/m L时对INS-1细胞产生显著的刺激胰岛素分泌作用(为基础释放量的120.04%;p0.01)。研究结果为Brevinin-2GUb多肽开发为降糖口服液及多肽药物奠定了基础。