鱼源藤黄微球菌三重PCR检测法的建立及耐药性分析

为鉴定感染黄颡鱼菌株fsznc-CL、建立一种快速检测的方法和探讨其耐药特性。采用形态学、理化特性及16S rDNA序列分析方法进行菌株鉴定,人工回归感染研究其致病性。通过对三对特异性引物的反应体系和条件进行优化,建立一种三重PCR检测法并应用到人工感染黄颡鱼的检测中。运用PCR方法扩增耐药基因,用琼脂纸片扩散法检测该菌的药敏特性。结果表明,分离菌株fsznc-CL为藤黄微球菌(Micrococcus luteus),该菌对黄颡鱼具有一定的致病性。三重PCR检测法可准确扩增出藤黄微球菌CBS、Sig和Pol三对目的基因,而其他菌株未扩增出,检测该菌的最低模板浓度为5.822×10-3 ng/μL,该方法检测带菌样品的阳性率约为83.33%。该菌携带了TEM、aph(3')-Ⅱa、aac(6')-Ⅰ、Sul1和Sul2耐药基因。菌株fsznc-CL对诺氟沙星、苯唑西林、红霉素和呋喃唑酮耐药。本试验建立的三重PCR检测法具有较高的特异性和灵敏度,目前藤黄微球菌对少部分抗生素耐药。     

致病性小肠结肠炎耶尔森氏菌分离鉴定及三重PCR检测方法的建立

为鉴定导致患病鲫鱼肛门红肿、腹部有出血点症状的病原菌,并建立一种快速检测该病原菌的方法。本研究从患病鲫鱼中分离了病原菌,采用形态学、理化特性分析及16S rDNA序列分析方法鉴定菌株。采用PCR扩增法检测该菌毒力基因,琼脂纸片扩散法检测该菌株的耐药性,致病性能验证试验检测其致病性。针对该菌ail基因、inv基因和intB基因设计了3条特异性引物,通过对反应体系和条件的优化,建立了一种检测该菌的三重PCR方法并初步应用于患病鲫鱼样品的检测中。结果显示,从患病鲫鱼心脏组织中分离了一株小肠结肠炎耶尔森氏菌（Yersinia enterocolitica）,命名为fsznc-10。检测到该菌携带ail、ystB、virF、intB毒力基因,该菌对诺氟沙星、庆大霉素等5种抗生素敏感,对鲫鱼具有一定的致病性。三重PCR方法可准确扩增出小肠结肠炎耶尔森氏菌ail、inv和intB三个目的基因,而其他菌株均未扩增出目的基因。该方法检测该菌DNA最低检出量为1.704×10?6 ng/μL,检测患病鱼心脏样品的阳性率约为86.67%,与16S rDNA序列分析方法的检测符合率为100%。本试验建立的三重PCR检测法具有特异性强、敏感性高、操作简单、成本低的优点。这为临床中小肠结肠炎耶尔森氏菌的防控和检测提供参考依据。