海洋来源褐藻胶裂解酶及其基因B1SM的克隆和表达

从海洋来源的假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.) B1基因组中克隆1个褐藻胶裂解酶基因,并在大肠杆菌中实现异源表达,分离纯化重组酶并研究其酶学性质。通过Touch down PCR与热不对称交错PCR(thermal asymmetric interlaced PCR,TAIL-PCR)从假交替单胞菌B1基因组中扩增到1个褐藻胶裂解酶基因(B1SM),将目的基因插入到p GEX-4T-1载体,转化到宿主大肠杆菌(Escherichia coli,E. coli) BL21 (DE3)。结果显示,从菌株B1克隆得到褐藻胶裂解酶基因B1SM,序列长度为1 005 bp,编码334个氨基酸,理论等电点为8. 51,编码蛋白质的理论分子质量为37. 13 k Da。重组褐藻胶裂解酶B1SM的最适pH和温度分别为8. 0和25℃。该褐藻胶裂解酶在pH 7. 0～9. 0范围内,25℃下保温1 h,仍剩余60%以上活力,pH稳定性较好。在最适pH 8. 0和30℃下保温1 h重组酶仍剩余60%以上活力。该研究为褐藻胶裂解酶基因B1SM在E. coli BL21(DE3)中实现了异源表达,为褐藻胶裂解酶的制备和研究奠定基础。     

酶解制备褐藻寡糖工艺优化及活性研究

为了优化褐藻胶裂解酶酶解褐藻酸钠制备褐藻寡糖的工艺条件,在单因素试验的基础上,运用软件DesignExpert 8.0.6设计中心组合试验,以反应体系中还原糖生成量为评价指标,采用响应面分析法确定褐藻胶裂解酶酶解的最优工艺,通过测定2,2'-联氮双-(3-乙基苯并噻唑林-6-磺酸)二铵盐[2,2'-azinobis(3-ethylbenzothi azoline-6-sulfonic acid)ammonium salt,ABTS]自由基的清除能力、抑菌指数和对对虾多酚氧化酶(polyphenol oxidase,PPO)活性的影响,检测酶解制备的褐藻寡糖的抗氧化活性和抑菌活性。结果显示最佳工艺条件:酶解时间16 h、体系pH值8.4、酶解温度30℃、底物质量浓度8 g/L。此条件下,还原糖质量浓度达到1 660 mg/L。结果显示制备的褐藻寡糖具有较强的清除ABTS~+自由基的能力和抑菌能力,并能有效的抑制对虾多酚氧化酶的活性。