赭曲霉毒素A时间分辨荧光侧流层析试纸条的研究

目的 构建一种基于时间分辨荧光纳米微球的赭曲霉毒素A (ochratoxin A, OTA)侧流层析试纸条。方法 基于免疫层析原理, 以时间分辨荧光纳米微球为信号探针, 降低非特异性荧光的干扰, 提高检测灵敏度, 并通过优化样品提取液和样品稀释液, 进一步提高现场检测OTA的灵敏度和准确性。结果 OTA在1~50 μg/kg范围内, T线和C线荧光强度的比值与OTA浓度的对数值具有良好的线性关系, 相关系数r2为0.9981~0.9998。不同基质中OTA的检出限(limit of detection, LOD)和定量限(limit of quantitation, LOQ)分别为0.401 μg/kg~0.614 μg/kg和0.970 μg/kg~1.617 μg/kg, 加标回收率为89.53%~118.37%, 相对标准偏差(relative standard deviations, RSDs)小于12% (n=3), 且与呕吐毒素、伏马菌素B1、黄曲霉毒素B1、玉米赤霉烯酮和T-2毒素的交叉反应率均小于5%, 特异性良好。基于荧光定量快速检测技术平台OTA侧流层析试纸条可在8 min内快速准确地定量检测出待测样本中OTA的含量。结论 本研究所制备的时间分辨荧光侧流层析试纸条可实现玉米、小麦和饲料中OTA的快速定量检测, 并具有成本低、灵敏度高、操作简便、准确高、重复性好、特异性好的优点, 可满足国内外OTA检测的技术要求, 为真菌毒素快检技术的发展提供技术支撑。     

免疫磁珠高通量自动净化-超高效液相色谱法快速测定饲料中玉米赤霉烯酮

采用免疫磁珠净化饲料原料及其产品中的玉米赤霉烯酮,实现玉米赤霉烯酮的自动富集、清洗和洗脱,结合超高效液相色谱对玉米赤霉烯酮进行分析测试。本文对饲料样品稀释液进行了优化。根据3倍信噪比的峰响应值,本方法玉米赤霉烯酮的检出限为4.5 μg/kg,定量限为15.0 μg/kg,在10~500 ng/mL范围内线性关系良好,相关系数（R2）为0.99993。玉米赤霉烯酮在鸡饲料和猪饲料样品中的加标回收率为92.6%~112.9%,相对标准偏差为1.0%~8.8%。对同一饲料基质进行连续4天同一浓度的加标实验,回收率为97.0%~98.9%,日间精密度在5.7%~5.9%。使用本方法与免疫亲和柱法进行比较,检测了19种饲料样品,t检验显示本方法与免疫亲和柱法无显著性差异。免疫磁珠自动净化法可同时净化24个样品,无需人员手动操作,减少实验误差,提高检测效率,满足饲料中玉米赤霉烯酮的日常检测要求。     

基于时间分辨荧光快速定量检测谷物中的T-2毒素

研制开发了一种基于时间分辨荧光纳米微球的T-2毒素快速定量检测卡,并对其在谷物中的检测性能进行了研究。本研究对标记工艺、划线工艺进行了探索,通过对微球偶联时间、封闭时间等优化,确认了最佳偶联时间为30 min,最佳封闭时间为60 min;通过对NC膜的筛选、划线湿度的摸索,确认了最佳NC膜为140膜,最佳划线湿度为45%～55%。同时,对该T-2毒素快速定量检测卡进行了性能验证：该检测卡的检测限为0.480μg/kg,定量限为1.020μg/kg,添加回收定量范围为1～100μg/kg,准确度86.09%～119.57%,重复性在11.95%以内,交叉反应率<5%。具有快速定量、简单便捷、高灵敏度、高特异性、可靠性强、重复性好等优点,适合对谷物中T-2毒素进行快速定量测定。     

基于适配体亲和磁珠的黄曲霉毒素B1单样本前处理试剂盒的制备及应用

黄曲霉毒素B₁(aflatoxin B₁, AFB₁)适配体共价偶联于磁珠表面制备适配体亲和磁珠(aptamer affinity magnetic beads, AAMB),将AAMB、孵育液、洗涤液和洗脱液预封装于试剂条中开发了AFB₁单样本前处理试剂盒,借助真菌毒素全自动净化仪实现了AFB₁前处理的自动化,使用超高效液相色谱仪对洗脱液中AFB₁的含量进行测定。通过优化磁珠粒径、适配体间接臂长度、适配体亲和磁珠用量、孵育液体积确定了AAMB的制备条件以及AFB₁单样本前处理试剂盒的使用条件,对比了手动和自动两种前处理方式下AAMB回收率的差异。在优化条件下,AFB₁的检出限(limit of detection, LOD)为0.6 ng/mL,玉米和小麦中低、中、高三个水平的加标回收率在92.8%～110.1%之间,日内精密度的相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)小...     

免疫磁珠高通量自动净化-超高效液相色谱法测定粮食中玉米赤霉烯酮

基于免疫磁珠高通量自动净化的前处理方法,使用超高效液相色谱仪对粮食中玉米赤霉烯酮的含量进行测定。首先将免疫磁珠与玉米赤霉烯酮的反应时间、样品提取液和不同粮食基质的净化效果进行优化。经方法验证,超高效液相色谱的检出限和定量限分别为3.5 μg/kg和12.0 μg/kg。在优化条件下,全麦粉和玉米全粉阴性样品的3 个添加水平的加标回收率在99.04%～109.26%之间,变异系数不大于6.88%。玉米全粉、全麦粉、糙米粉、小麦粉等粮食基质中玉米赤霉烯酮成分的国家有证标准物质或质控样品的测定结果在标准值及其扩展不确定度范围内,变异系数不大于3.54%,测定结果较为满意。采用Bland-Altman法对免疫磁珠净化法和免疫亲和柱净化法之间的差异进行分析,结果显示这2 种净化方法的差异在可接受范围内,因此,这2 种方法在净化和富集粮食中玉米赤霉烯酮时可互相代替使用。免疫磁珠净化方法配套使用的真菌毒素全自动净化仪可同时净化10～24 个样品,平均每个样品的净化时间约为2～3 min,实现粮食中玉米赤霉烯酮的高通量自动净化。超高效液相色谱分析速度快、灵敏度高、准确性高,可用于检测粮食中玉米赤霉烯酮的含量。     

基于金纳米棒金属化的呕吐毒素多色可视化检测方法研究

目的 基于免疫亲和反应和酶诱导金纳米棒金属化构建一种呕吐毒素多色可视化检测方法。方法 将表面修饰高亲和性抗体的免疫磁珠作为信号转移载体,将金纳米棒作为多色反应基底,样品中的呕吐毒素与生物素修饰的呕吐毒素抗原竞争结合磁珠表面的抗体上,进一步基于生物素和链霉亲和素的特异性亲和反应,链霉亲和素标记的碱性磷酸酶被结合到免疫磁珠上,并催化底物L-抗坏血酸-2-磷酸三钠盐生成抗坏血酸,随后还原硝酸银生成银单质包被在金纳米棒表面。该过程使金纳米棒的纵向等离子体吸收峰发生蓝移,同时产生裸眼可见的丰富颜色变化。优化了缓冲溶液pH、底物浓度、硝酸银浓度、催化反应时间。结果 在最佳反应条件下,检测呕吐毒素的线性范围是0-1000 ng/mL,检出限为264.71 ng/mL,对小麦和玉米质控样品的检测结果回收率在101.3%-110.5%之间,相对标准偏差小于14.1%。结论 检测结果直观,灵敏度较高,操作便捷,无需步骤复杂的人工操作,检测过程用时较短,可用于粮食中呕吐毒素的可视化检测。     

真菌毒素适配体筛选技术研究进展

真菌毒素遍布于粮食生产、贮藏、运输和加工等各个环节,其污染已经成为全球亟待解决的问题。对真菌毒素进行监测并配合使用各种有效的降毒手段,有助于真菌毒素污染问题的解决。目前,真菌毒素检测、监控和靶向降解所用识别元件多为抗体,但抗体存在价格昂贵、批次间差异性大、热稳定性差等缺点,限制了其应用,而适配体合成简单、热稳定性强、免疫原性小、几乎无批次间差异等优点,有望取代抗体,但目前有关适配体商业化应用仍旧很少。本文概括总结了以真菌毒素为靶标的适配体筛选技术及其所筛适配体情况,并分析了适配体商业化应用仍旧很少的原因,以及各种筛选技术所面临的问题和挑战,以期为真菌毒素适配体的筛选提供参考,促进粮食中真菌毒素污染问题的解决。     

基于时间分辨荧光纳米微球的伏马毒素B1快速定量检测卡的制备及应用

为了满足粮食谷物中伏马毒素B1快速定量检测的需求,以伏马毒素B1为研究对象,建立了基于时间分辨荧光纳米微球的FB1荧光快速定量检测卡,检测前无需调整样品提取液pH,并借助酶联免疫试剂盒及高效液相色谱法分析比对了该荧光定量快速检测卡在粮食谷物（大米、玉米、小麦）中的检测性能。结果表明其检测不同样品的LOD在35.37~37.17 μg/kg之间,LOQ在117.9 ~123.9 μg/kg之间,灵敏度良好;线性范围均为250~6 000 µg/kg,相关系数R2在0.997 2~0.999 5之间;不同样品中6个添加水平的加标回收率为83.38%~114.66%,变异系数（CV）小于15%,准确性和重复性良好;国标液相色谱法和伏马毒素B1荧光定量快速检测卡同时检测FB1污染的不同样品,检测结果的符合度为92.53%~106.26%,CV小于10.37%;与其他常见的5种真菌毒素的交叉反应率均小于5%,且添加浓度和检出浓度的差异极显著,表明特异性良好。因此,所制备的FB1荧光定量快速检测卡能够满足粮食谷物中伏马毒素B1现场化快速定量检测的需求。     

基于适配体生物传感器检测黄曲霉毒素B1的研究进展

随着生活水平的提高, 人们对生命健康格外注重, 而由生物毒素引起的食物中毒的悲剧却频繁发生, 因此得到了社会的广泛关注。简便快速、特异性高、易携式的生物毒素检测仪器成为研究人员研究的热点。适配体(aptamer)作为一种新型识别分子, 具有亲和力高、稳定性强、制备成本低、特异性强等明显优势, 已成功应用于食品中有害物质的识别检测。随着色谱技术、免疫化学以及光、电等领域的不断发展, 将适配体与靶物质的特异性识别结合过程转换为易于检测的物理化学信号, 能够实现灵敏度高、微型化、高通量和现场检测的快速分析。本文主要从试纸条法、荧光、电化学传感器等方面以黄曲霉毒素B1(aflatoxin B1, AFB1)为靶标的适配体在食品安全检测分析中的应用进行了综述, 以期为进一步研究提供参考。     

全自动免疫亲和固相萃取超高效液相色谱法高通量测定粮油中黄曲霉毒素

建立了全自动柱固相萃取超高效液相色谱法高通量测定粮油中黄曲霉毒素的分析方法。样品经84/16（v/v）的乙腈/水涡旋振荡提取20 min,700 0 转/min,离心5 min,0.1% PBST水溶液10倍稀释后,稀释液置于全自动固相萃取仪样品架上,选取柱本底未检出,柱回收在90 %以上的黄曲霉毒素免疫亲和柱进行全自动免疫亲和净化富集,上样速度为5 ml/min,2 ml甲醇洗脱,50 ℃下氮气吹干,1 mL流动相复溶上机检测。结果表明:方法的加标回收率为 85%~104%,日内相对标准偏差为1.8 %~3.0 % ,日间精密度为1.8 %~4.8 %。测定三种基体质控物质的结果均在标示值范围内,测定结果准确可靠。通过配对t检验,仪器间无显著台间差,多次重复验证无仪器残留,方法稳定性优于手动法。利用本方法对样品中黄曲霉毒素B1进行了测量不确定度评定,不确定度的主要来源是标准储备液、标准曲线配制和回收率。本方法能够最大限度地解放实验人员,提高工作效率,还可避免因人员操作导致的结果偏差,适用于大量粮油中黄曲霉毒素的精准测定。