生物丁醇代谢工程的研究进展

丁醇作为一种重要的大宗化学品具有广泛的用途,同时又是一种潜在的生物燃料。随着能源与环境危机的日益加重,利用可再生原料通过微生物法生产丁醇受到全世界的普遍关注。代谢工程为定向改造微生物生产丁醇提供了有力的工具。通过改造经典的丙酮丁醇发酵和定向改造模式微生物生产丁醇是生物丁醇研究的两个重要方向。笔者从代谢工程改造的角度评述近5年来生物丁醇研究的进展,同时讨论了生物丁醇研究中需要着力解决的问题。     

丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统

丙酮丁醇梭菌是极具潜力的替代燃料——生物丁醇的合成菌,受到各国研究者的普遍关注。丙酮丁醇梭菌菌株改造是生物丁醇产业化进程中的一项重要工作,其中遗传操作是核心内容之一。以下对丙酮丁醇梭菌的遗传操作系统的发展历史、种类和原理进行了综述,分析了目前几种遗传操作系统的局限性,并对其发展进行了展望。     

利用Tn5转座子介导突变提高大肠杆菌丁醇生产水平

目前,对于构建高产丁醇大肠杆菌工程菌株的工作,主要是对丁醇通路和相关途径的基因进行理性改造。为进一步提升菌株的丁醇生产能力,需要发掘基因组上可影响丁醇生产能力的基因,但这很难通过已有认识或计算机模型进行预测。本工作以一株实验室前期构建的产丁醇大肠杆菌工程菌株为研究对象,利用Tn5转座子构建了一个含有1 196个菌株的突变文库。丙酮酸是丁醇的前体,并且在发酵终产物中,副产物丙酮酸的含量与丁醇的含量呈反相关,因此,可以利用丙酮酸的含量来间接反映丁醇的含量,而丙酮酸可用二硝基苯肼显色法进行快速测定,基于此,建立了96孔板——酶标仪快速筛选方法。利用该方法成功筛选到了比对照菌株丁醇产量提高了29%、49%、56%的3个突变体菌株。利用反向PCR及测序的方法,确定了其转座子插入位置分别为:pyk A、tdk、cad C基因。这些基因可以作为进一步提高菌株丁醇产量的靶点,同时这种利用Tn5转座子筛选基因靶标的策略也为构建其他微生物细胞工厂提供了新思路。     

一种适用于产朊假丝酵母的基因敲除系统及其在gsh1基因敲除中的应用

报道一种适用于产朊假丝酵母Candida utilis的基因敲除系统,利用该敲除系统获得gsh1基因敲除杂合突变株。根据不同种属酵母菌γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)蛋白质的保守序列,克隆C.utilis SZU 07-01的gsh1基因;以商品化质粒pPICZalpha A为基础,构建gsh1基因的敲除载体pPICZalpha A-kan 3,其中,kan基因的启动子TEF被替换为来自于C.utilis SZU 07-01的GAP启动子(pGAP:kan)。质粒电转化C.utilis,获得gsh1基因敲除杂合突变株C.utilis GSH-6。结合发酵培养得到的数据进行分析,突变株的γ-GCS酶活比出发菌株降低17.5%,GSH合成量降低61%,细胞干重降低18.5%。所构建敲除组件pGAP:kan的成功应用为从分子水平研究C.utilis中谷胱甘肽(GSH)的生理功能提供了一种新借鉴。