腾冲嗜酸热两面菌S5分子伴侣β亚基的表达、纯化和活性的初步分析

用NdeI和BamHI酶切回收腾冲嗜酸热两面菌S5的分子伴侣β亚基基因片段插入pET-23b的相应位置,并分别在BL21(DE3)和Rosetta-gami~(TM)B(DE3)pLysS中表达。表达的β亚基以可溶的形式存在。β亚基在Rosetta-gami~(TM)B(DE3)pLysS中表达较高,其占菌体总蛋白的16．2%,且以单体和聚体形式同时存在。表达的菌体经超声破碎、70℃热处理后,上清中β亚基蛋白含量达到30%,再经(NH_4)_2SO_4沉淀、Bio-Gel A-1．5m和DEAE-Sepharose CL-6B柱层析,得到在SDS-PAGE呈电泳均一的β亚基,Native-PAGE表明其为聚体,有弱的ATPase活性。     

产青霉素酰化酶的大肠杆菌AS1.76的固定化

用在有机溶剂中成型的琼脂凝胶包埋,结合戊二醛处理的方法,制备产青霉素酰化酶的大肠杆菌AS1.76固定化细胞,其细胞含量可达50%以上。固定化细胞水解青霉素 G 钾盐的最适 pH 为8.0,比原细胞约高0.3pH 单位;最适温度与原细胞一样,均为45℃。固定化后,Hg2+对酶抑制作用降低,但酶对Fe3+、Cu2+等金属离子敏感性增加。在无底物情况下,与原细胞相比,固定化细胞对 pH 和热的稳定性增加;4℃保存14个月无活力损失。固定化细胞装柱,在pH7.7,37℃下连续裂解青霉素 G,转化率达95%以上。155天无明显酶活力损失。     

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究III．酶与多核苷酸复合物的形成

固定化多核苷酸磷酸化酶(简称PNP酶)在催化聚合反应过程中与合成的多核苷酸相联,形成酶多核苷酸复合物。反应产物分析表明：反应液中除了残留未经反应的底物以及大分子聚合物外,未检查出中间寡聚物。以上结果提示,固定化PNp酶催化聚合反应机制为连续反应。     

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究——Ⅱ.用固定化酶制备Poly I和Poly C

固定化PNP酶柱反应器在pH9,37℃,含有6微克分子/毫升MgCl_2,0.04%NaN_3,11～12微克分子/毫升CDP(IDP)的条件下,连续聚合反应1.5～2个月,转化率基本不变。所得的Poly I,Poly C用Lowry法测不出蛋白,紫外吸收光谱符合标准。按人体用量放大350～400倍进行急性动物毒性试验证明无毒害作用。可以省去自然酶制备Poly I,Poly C过程中酚脱蛋白的工艺。     

凝乳酶原(凝乳酶)二硫键Cys206-Cys210的定位突变

在对凝乳酶原二硫键Cys206\|Cys210进行定位突变过程中发现,在相应的模板序列中有自身形成自由能为-16.1kcal/mol的茎环结构倾向,妨碍与引物结合,从而难以合成突变的DNA,采用快退火可解决此矛盾。5个突变基因均能在大肠杆菌中高效表达,除C206A外,约占细胞总蛋白的50%左右。突变体的复性结果表明,Cys206\|Cys210对凝乳酶原正确折叠不是绝对必需的,但相应位置的氨基酸取代对复性效率有显著影响,在5个突变体中,C206A/C210A的复性率分别为C206S/C210S\,C210A\,C210S的4.5倍、20倍和30倍,而C206A完全不能复性。C206A/C210A与C206S/C210S的远紫外CD光谱与野生型基本相同,其荧光发射光谱与野生型相比最大发射峰不变,而荧光强度有显著增加。由于上述3个蛋白具有相同比活,说明突变分子能形成具有生物活性的空间构象,而只是某些色氨酸残基微环境受到微扰。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究 Ⅰ.酵母变异株20B-12 RNA聚合酶A和C的纯化及鉴定

从酵母变异株20B-12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素和磷酸纤维素层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶A和C,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的条带。其中不含DNase、RNase 和蛋白酶活力,无内源DNA。测定了 RNA 聚合酶A和C对α-鹅膏荤碱的敏感性。酶A在α-鹅膏荤碱为400μg/ml时,活性受到抑制,而酶C在该浓度时,几乎不受抑制。(NH_4)_2SO_4对酶A的最适浓度为20mM,对酶C有二个最适浓度,分别为40mM和240mM。无二价金属离子Mn~(2+)或Mg~(2+),酶A和C几乎无活力。两种酶最适Mn~(2+)浓度均为2.5mM,Mg~(2+)浓度均为5mM。两种酶以热变性小牛胸腺DNA为模板,测活性均较天然小牛胸腺DNA为模板时高。     

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究——Ⅰ.固定化多核苷酸磷酸化酶的制备及其基本性质

对-重氮基苯磺酰乙基琼脂糖是制备固定化多核苷酸磷酸化酶的较好材料,与具有同样活性基团的纤维素和葡聚糖凝胶G200相比,活力回收高、稳定性好。固定化酶的最适pH 向偏碱的方向转移,最适温度较自然酶为宽,表观米氏常数与自然酶基本一致。57℃保温30分钟尚保留70%以上的活力,而自然酶仅剩余22%的活力,说明稳定性有所提高。     

固定化多核苷酸磷酸化酶的研究——Ⅰ.固定化多核苷酸磷酸化酶的制备及其基本性质

对-重氮基苯磺酰乙基琼脂糖是制备固定化多核苷酸磷酸化酶的较好材料,与具有同样活性基团的纤维素和葡聚糖凝胶G200相比,活力回收高、稳定性好。固定化酶的最适pH向偏碱的方向转移,最适温度较自然酶为宽,表观米氏常数与自然酶基本一致。57℃保温30分钟尚保留70%以上的活力,而自然酶仅剩余22%的活力,说明稳定性有所提高。     

凝乳酶β-转角突变体的构建、表达和性质分析

为了阐明牛凝乳酶的第二个发夹结构中的Ⅵ型β-转角的功能,利用基因突变技术,将该转角的氨基酸残基(Leu20-Gly21-The22-Pro23-Pro24-Gln25)改为(Leu20-Gly-Gly-Gln25)、(Leu20SerGlyGln25)或(Leu20GlySerGln25),得到3个突变牛凝乳酶原表达质粒Pmcgg,Pmcsg和Pmcgs。除Pmcgs不能在大肠杆菌中表达外,Pmcgg和Pmcsg均能以包含体的形式进行表达,且表达水平与野生型相当。像野生型凝乳酶原一样,Pmcgg和Pmcsg的表达产物经过变性复性,均能自活化为假凝乳酶,而且复性后的酶原突变体在DEAESepharose CL6B上的柱行为与野生型相类似,但突变体假凝乳酶的凝乳及水解酪蛋白活性均明显低于野生型。说明突变对酶原的折叠影响较小,但对酶的催化效率影响较大。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究I．酵母变异株20B-12 RNA聚合酶A和C的纯化及鉴定

从酵母变异株20B一12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素和磷酸纤维素层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶A和C,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的条带。其中不含Dnase、Rnas：和蛋白酶活力,无内源．DNA。测定了RNA聚合酶A和c对弘鹅膏蕈碱的敏感性。酶A在a-鹅膏荤碱为400μg／ml时,活性受到抑制,而酶c在该浓度时,几乎不受抑制。(NH4)zSO4对酶A的最适浓度为20mM,对酶C有二个最适浓度,分别为40raM和240raM。无二价金属离子Mn+或Mg2+,酶A和c几乎无活力。两种酶最适Mn2+浓度均为2.5mM,Mg2+浓度均为5mM。两种酶以热变性小牛胸腺DNA为模板,测活性均较天然小牛胸腺DNA为模板时高。