一种来源于兼性嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703的β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶

N-乙酰氨基葡萄糖苷酶作用于肽聚糖或几丁质,从其非还原末端水解产生β-D-N-乙酰氨基葡萄糖单体,该酶在细胞壁代谢过程中起重要作用,在医药和生物技术领域也有广泛的应用。【目的】克隆表达来源于兼性嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶NagZ703,为获得乙酰氨基葡萄糖单体奠定基础。【方法】以B.pseudofirmus703基因组DNA为模板,克隆得到了β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶基因NagZ703,通过构建pET28a-nagZ703表达载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达NagZ703,利用镍柱纯化得到NagZ703纯蛋白,并对其酶学和生化性质进行分析。【结果】NagZ703与其同源蛋白多序列比对分析结果表明,NagZ703属于糖苷水解酶3家族(GH3),由2个结构域构成,催化活性中心由位于N端结构域的Arg232-His234-Arg318组成,和研究最多的Bacillussubtilis168来源的BsNagZ氨基酸的序列相似性为37%。酶学性质分析表明,以对硝基酚-β-乙酰氨基葡萄糖苷(pNP-β-GlcNAc)为底物,NagZ703的最适反应温度和pH分别为60°C和pH 6.5,比酶活为10.79 U/mg,其Km和Vmax分别为0.276 mmol/L和0.612 mmol/(mg·min)。该酶具有较好的稳定性,在50°C处理30 min,或在pH 6.0–10.5条件下,4°C保存12 h后,仍保留80%以上的酶活力。EDTA不影响该酶的活性,推测其为非金属依赖酶,且Hg2+可完全抑制酶活性。【结论】本研究将兼性嗜碱菌Bacillus pseudofirmus 703来源的β-N-乙酰葡糖胺糖苷酶NagZ703在大肠杆菌中成功表达和纯化,并分析了其酶学性质;NagZ703的最适pH为6.5,没有表现出耐盐嗜碱的特征;NagZ703能水解胶体几丁质产生GlcNAc,为酶解生产GlcNAc提供了一条可行的思路。     

我国社区儿童皮肤感染金黄色葡萄球菌的耐药研究

为分析我国社区儿童皮肤感染来源的金黄色葡萄球菌流行特点及耐药现状,明确社区获得性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(CA-MRSA)中mecA基因携带情况及葡萄球菌盒式染色体SCCmec基因分型情况,并为临床治疗选择合理而有效的治疗方案提供依据,本文对全国13家儿童医院1 416例皮肤感染患儿的皮损分泌物进行细菌培养,应用琼脂稀释法检测16种抗生素对培养出的金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度,应用聚合酶链式反应对CA-MRSA进行mecA基因检测及SCCmec基因分型。从1 416例患儿皮损中培养出金黄色葡萄球菌1 043株,对16种抗生素的药敏试验结果显示,耐药率前3位依次为红霉素97.3%,青霉素96.7%,克林霉素89%,其次为四环素42.2%、氯霉素15%、庆大霉素9.8%、环丙沙星6.6%、复方新诺明4.6%、苯唑西林3.4%、头孢呋辛3.1%、利福平2.4%、头孢曲松1.7%、头孢唑啉1.6%、夫西地酸1.3%、莫匹罗星0.8%。CA-MRSA分离率为3.4%,各地区均未发现万古霉素耐药或中介耐药菌株。35株CA-MRSA均携带mecA基因,SCCmec基因分型结果为Ⅳ型14株（40%）、Ⅴ型19株（54.3%）、未定型2株（5.7%）。本研究提示,治疗我国社区儿童皮肤金黄色葡萄球菌感染性疾病,仍首选全身应用耐青霉素酶的半合成青霉素和第1、2代头孢菌素,其他可选择的有夫西地酸、复方新诺明、利福平、万古霉素,外用治疗选择莫匹罗星,具有较好的抗菌活性。我国儿童CA-MRSA中mecA携带率100%,SCCmec Ⅳ和Ⅴ型为主要类型。