成年大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除小鼠模型的建立与鉴定

去整合素和金属蛋白酶10(ADAM10)是一种能够水解30余种跨膜蛋白质的“脱落酶”(sheddase), 参与诸多生理过程和致病机制, 如胚胎发育、细胞粘附、信号转导、免疫反应、癌症和阿尔茨海默病。迄今, 已报道的ADAM10完全基因敲除小鼠和大脑神经前体细胞特异性ADAM10基因敲除小鼠分别于胚胎期或围产期死亡, 致使无法研究成年小鼠大脑神经细胞ADAM10基因的功能。文章利用本研究小组建立的CaMKIIα-Cre转基因小鼠与ADAM10^loxP/loxP转基因小鼠杂交, 获得了CaMKIIα-Cre/ADAM10^loxP/loxP小鼠, 并对其进行鉴定。利用PCR方法检测成年ADAM10 cKO小鼠大脑基因组DNA表明, ADAM10基因缺失主要发生在前脑皮层和海马中。荧光定量PCR检测结果显示, ADAM10 mRNA的表达水平在前脑皮层和海马中分别降低55.7%和60.8% ; 使用Western blotting方法研究发现, ADAM10成熟蛋白质的含量在前脑皮层和海马中分别减少63%和84.8% 。采用免疫组织化学方法检测表明, 成年ADAM10 cKO小鼠与野生型小鼠相比, 其大脑皮层和海马神经细胞的ADAM10免疫染色明显减弱, 而其它细胞如胶质细胞的免疫染色基本一致。总之, 文章成功制备了首个存活至成年的大脑神经细胞特异性ADAM10基因敲除(cKO)小鼠, 克服了小鼠因ADAM10缺失在胚胎期或围产期死亡的弊端, 为研究成年小鼠大脑神经细胞ADAM10基因的功能奠定了坚实的基础。     

p35Nck5a基因重复性打靶载体的构建和ES细胞基因打靶研究

为了在小鼠胚胎于细胞（ＥＳ）中引起神经细胞ｃｄｃ２类激酶调节亚基ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的定点 重复,采用常规的分子克隆技术,构建得到长约１２．２ｋｂ的基因重复性打靶载体ｐＧＤＴＶ。用电 穿孔法将线性化的ｐＧＤＴＶ载体转入ＥＳ细胞,经过Ｇ４１８和ＧＡＮＣ分组药物选择,获得２４５个 双药物抗性的细胞克隆,细胞存活率为６．２２ × １０－５。经ＰＣＲ和基因组Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交鉴定,２个 ＥＳ细胞克隆发生了ｐ３５Ｎｃｋ５ａ基因的重复,同源重组率为５．０８×１０－７、负向选择系统的应用使 同源重组事件的富集效率提高了７倍。为建立Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病的转基因小鼠模型打下了基础。     

中国“丝绸之路”地区血红蛋白病的遗传流行病学特点

对“丝绸之路“沿线陕、甘、新等省区的22万余人进行了血红蛋白病调查,应用蛋白质一级结构分析技术,从271例异常血红蛋白先证者中,发现变异体24种,以HbD Punjab、HbG TaiPei、HbG Coushatta 频率较高,呈梯度分布,其中HbJ Tashikuergan和Hb Tianshui 为世界新种异常血红蛋白。采用基因鉴定技术,于85例β地中海贫血携带者中,确定基因突变类型12种,以CD17（A→T）频率最高,其中[-28(A→G）.CD17(A→T）/N]双重突变杂合子,为同一染色体上的双重基因突变。极为罕见,CD8（－AA）、CDs8/9( G）为中国人中首次发现。根据“丝绸之路”地区异常血红蛋白和地中海贫血的类型特点、地理及民族分布规律,本文认为①我国西北部民族主要由中亚高加索人,黄河流域汉族人和蒙古高原的古代游牧民族组成。②β地贫CD17突变基因可能起源于甘肃的陇原大地,随华人迁徙传入东南亚各地。③该地遗传背景复杂,突变基因具有高度的异质性,存在显著的遗传流行病学特点。     

p35^Nch5a基因重复性找靶载体的构建和ES细胞基因打靶研究

为了在小鼠胚胎干细胞（ES）中引起神经细胞cdc2类激酶调节亚基p35