倭蜂猴粪便微生物苯酚羟化酶和邻苯二酚1,2-双加氧酶基因多样性研究

【目的】分析倭蜂猴粪便微生物中苯酚羟化酶(Phenol hydroxylase,PH)和邻苯二酚1,2-双加氧酶(Catechol 1,2-dioxygenase,C12O)的基因多样性。【方法】利用简并引物,以倭蜂猴粪便微生物宏基因组DNA为模板,通过PCR扩增,分别构建PH和C12O基因克隆文库,并对克隆进行测序分析。【结果】倭蜂猴粪便微生物来源的PH和C12O基因序列经BLAST比对分析,与GenBank中相应酶的序列一致性分别介于92%?100%和87%?100%。系统进化树分析表明PH基因序列与Neisseria、Burkholderia、Alcaligenes、Acinetobacter 4个属来源的PH序列相关;C12O基因序列全部与Acinetobacter来源的C12O序列相关。序列比对结果表明PH序列具有LmPH (Largest subunit of multicomponent PH)中高保守的两个DEXRH结构域;C12O序列具有能被Ag+和Hg2+抑制的位点(半胱氨酸)。【结论】倭蜂猴粪便微生物来源的PH为多组分PH,其降解苯酚的中间产物邻苯二酚可以被C12O通过邻位开环途径裂解。     

一株产透明质酸酶的菌株鉴定及酶学性质研究

透明质酸酶可用于药物渗透剂、动物皮革松散及低分子量的透明质酸制备.实验室前期筛选了一株具有较高透明质酸降解能力的菌株,本研究对其进行了 16S rRNA基因和生理生化反应鉴定,鉴定为弗氏柠檬酸杆菌,但弗氏柠檬酸杆菌来源的透明质酸酶的功能还未见报道.因而,以透明质酸为底物研究其酶学性质,结果表明:该酶最适pH值为5.5,在pH值4.0～8.0下处理1 h可以保持60％以上酶活力;最适温度为50℃,在50℃和60℃下处理1h后剩余60％以上的酶活力.该酶和人源透明质酸酶最适pH相似,但其耐热性更高.因此,本研究挖掘到了新颖的透明质酸酶的资源,并为其开发利用提供了参考价值.     

粪便微生物宏基因组来源的热稳定性邻苯二酚1,2-双加氧酶异源表达及酶学性质

【目的】克隆倭蜂猴粪便微生物宏基因组的邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对该酶进行异源表达及酶学特性研究。【方法】利用宏基因组高通量测序技术获得cat PLCgl,并对其氨基酸序列进行分析。将cat PLCgl重组到载体p EASY-E2中并转化到大肠杆菌BL21(DE3)中异源表达,研究其酶学性质。【结果】cat PLCgl全长852 bp,G+C含量48%,编码283个氨基酸,理论分子量为33.56 k D。重组Cat PLCgl酶学性质分析显示最适作用p H为7.0,其中在p H 7.0–10.0范围内处理1 h后,酶活剩余90%以上;最适作用温度为40°C,在25°C和40°C条件下稳定性较好,耐受210 h酶活性几乎不变。重组酶在最适条件下的动力学参数K_m、V_(max)和k_(cat)分别为24.9μmol/L、8.3 mmol/(min·g)和13.7 s~(-1);Fe~(2+)、Hg~(2+)、Cu~(2+)、Triton X-100、SDS、Ag+强烈抑制该酶活性,而其它金属离子及有机试剂影响较小。【结论】从倭蜂猴粪便微生物宏基因组中克隆得到邻苯二酚1,2-双加氧酶基因cat PLCgl,并对重组Cat PLCgl酶学性质进行研究,该酶具有较好的热稳定性和耐碱性,在降解环境中的邻苯二酚和生产顺,顺-己二烯二酸方面具有应用潜力。     

透明质酸酶的研究进展

透明质酸酶是能降解透明质酸及部分糖胺聚糖的一类糖苷酶,可应用于医疗和美容等领域。透明质酸酶也可用于制备小分子糖胺寡糖,许多研究发现小分子糖胺寡糖具有比大分子糖胺聚糖更高的生物免疫活性。为便于研究人员对透明质酸酶进行进一步的基础研究及应用研究,本文介绍了透明质酸和透明质酸酶,梳理了透明质酸酶的分类、结构和催化机理,归纳总结了透明质酸酶的酶活力测定方法、重组表达、酶学性质和应用,展望了透明质酸酶的研究方向。     

糖胺聚糖降解菌株的筛选及鉴定

以土壤为材料,用透明质酸和硫酸软骨素为唯一碳源富集分离菌株,通过BSA-乙酸平板显色法及比色定糖法进行筛选。从80份土壤中筛选出13株糖胺聚糖降解活性的菌株并对其进行了16S rDNA测序鉴定。结果表明,筛选到13株糖胺聚糖降解菌株均具有透明质酸酶和硫酸软骨素酶活性;获得8株尚未报导过的产糖胺聚糖降解酶活性菌株。本研究为开发新型的糖胺聚糖降解酶提供参考。     

β-木糖苷酶的生物活性物质转化功能研究进展

β-木糖苷酶是木聚糖酶酶系的一种酶,其功能主要是降解半纤维素中最常见及含量最高的组分——木聚糖。近些年,研究人员发现一些微生物来源的β-木糖苷酶具有生物活性物质转化功能,可通过转糖基作用形成带有木糖基的生物活性物质,也可通过水解作用将带有木糖基的物质,如三七皂苷R1和R2、黄芪甲苷IV (astragaloside IV,ASI)、7-木糖-10-去乙酰紫杉醇(7-xylosyl-10-deacetyltaxol,XDT)和花青素转化为生物活性物质,因此,这些β-木糖苷酶在食品和医药等领域具有巨大的潜在应用价值。此外,研究人员揭示了β-木糖苷酶在生物活性物质转化功能方面的一些机制。本文主要介绍了β-木糖苷酶的生物活性物质转化功能、酶来源、家族分类、转化机制及应用,以期为β-木糖苷酶的进一步开发利用提供参考。     

金黄色葡萄球菌透明质酸裂解酶HylS的异源表达与特性研究

透明质酸酶能够将透明质酸聚糖降解成具有抗氧化等生物活性的低分子量寡糖.微生物来源透明质酸酶具有酶学性质多样和易于重组表达等特点,是开发透明质酸酶的研究热点.通过基因组测序获得一个潜在的金黄色葡萄球菌来源透明质酸裂解酶基因hylS,将其进行了大肠杆菌BL21(DE3)异源重组表达,并对重组酶进行了酶学特性和酶解产物抗氧化...     

外切菊粉酶的酶学研究进展

菊粉富含于菊芋、菊苣等多种菊科植物中,是一种来源丰富的可再生资源。菊粉是一种由D 呋喃果糖经β-2, 1-糖苷键连接,还原端经α-1, 2-糖苷键连接1个葡萄糖残基构成的果聚糖。菊粉能被菊粉酶水解,生产果糖、高果糖浆、菊粉寡糖,可通过微生物发酵生产燃料酒精等产品,在食品、生物能源、医疗保健等方面都有重要应用,受到广泛关注。介绍外切菊粉酶的分类、来源、结构和催化机理,重点总结近10年微生物来源外切菊粉酶的重组表达和酶学性质情况,简述外切菊粉酶在食品、能源等方面的应用,展望外切菊粉酶的研究热点及方向。     

黑颈鹤粪便分离菌Arthrobacter sp. GN14 的α-半乳糖苷酶基因克隆、表达与酶学特性

【目的】克隆高原唯一珍惜鹤类——黑颈鹤粪便分离菌Arthrobacter sp.GN14的α-半乳糖苷酶基因agaAGN14,并对该酶进行序列分析、系统发育分析和重组酶的酶学特性分析。【方法】利用简并PCR和GCTAIL-PCR方法获得agaAGN14全长,并对其氨基酸序列(AgaAGN14)进行比对和neighbor-joining系统发育树的构建。将agaAGN14重组到载体pET-28a(+)中并转化到Escherichia coli BL21(DE3)中异源表达。利用组氨酸标签纯化重组α-半乳糖苷酶rAgaAGN14并进行酶学性质分析。【结果】agaAGN14全长2109 bp,GC含量66.8%,编码702个氨基酸(77.5 kDa)。AgaAGN14与数据库中序列的最高一致性为53.7%,与其余胃肠道环境α-半乳糖苷酶的一致性<43%。系统发育分析将AgaAGN14聚于具有催化域KWD和SDXXDXXXR的α-半乳糖苷酶分支,与土壤微生物来源α-半乳糖苷酶距离相对较近,而与其余胃肠道环境α-半乳糖苷酶距离相对较远。rAgaAGN14可水解pNPG、棉籽糖、密二糖、水苏糖、菜粕和棉籽粕,表观最适pH为6.5,在pH 6.0-pH 9.0的范围内稳定并维持50%以上的酶活性。rAgaAGN14的表观最适温度为45℃,在10℃、20℃和37℃内稳定并分别具有约28%、30%和80%的酶活。在45℃pH 6.5条件下,rAgaAGN14对pNPG的Km、Vmax和kcat分别为0.41 mmol/L、18.28μmol/min/mg和25.36 s-1。rAgaAGN14受Ag+、Hg2+及SDS抑制,受K+、Ca2+、Mn2+、Fe3+、Ni2+、Cu2+和β-mercaptoethanol部分抑制,受Co2+、Pb2+、Zn2+、Mg2+、Na+和EDTA的影响较小。【结论】首次报道从黑颈鹤粪便中分离到Arthrobacter菌,并对该属细菌α-半乳糖苷酶进行序列分析、系统发育分析、异源表达和重组酶的酶学特性分析。rAgaAGN14序列较新颖,其酶学特性可能是同时适应黑颈鹤肠道环境和高原淡水湿地环境的结果。     

滇金丝猴粪便微生物GH10家族木聚糖酶基因多样性

【目的】分析滇金丝猴粪便微生物中GH10家族木聚糖酶的基因多样性。【方法】以野生和半圈养滇金丝猴粪便微生物宏基因组DNA为模板,用GH10木聚糖酶简并引物扩增木聚糖酶基因片段,利用p MD19-T载体构建细菌克隆文库并进行分析。【结果】从野生和半圈养滇金丝猴粪便微生物克隆文库中分别获得26、28条GH10木聚糖酶基因片段,与Gen Bank中木聚糖酶序列一致性分别介于58%-95%、63%-81%之间。比对分析表明,两种环境中的GH10木聚糖酶均来自厚壁菌门、拟杆菌门和未培养细菌。野生滇金丝猴粪便微生物的GH10木聚糖酶基因来源于Uncultured bacterium和Butyrivibrio、Bacteroides、Ruminococcus、Sphingobacterium、Chryseobacterium、Clostridium、Bacillus 7个属;而半圈养滇金丝猴粪便微生物的GH10木聚糖酶基因来源于Uncultured bacterium和Clostridium、Paludibacter、Sphingobacterium、Ruminococcus、Roseburia、Chryseobacterium 6个属,其中两种环境都存在来源于Ruminococcus、Clostridium、Chryseobacterium、Sphingobacterium的GH10木聚糖酶。【结论】滇金丝猴粪便微生物中含有丰富的GH10木聚糖酶基因,且野生和半圈养两种不同环境中GH10木聚糖酶基因的微生物来源存在一定差异。该研究丰富了动物胃肠道中GH10木聚糖酶基因多样性,并为新型木聚糖酶的开发和滇金丝猴胃肠道微生物资源的利用奠定了基础。