HCMV感染抑制人海马神经干细胞分化

研究HCMV感染对体外培养的人海马源性神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)分化的影响。体外分离、培养人海马NSCs,应用免疫荧光方法检测其NSCs标记物-巢蛋白(Nestin)的表达。10%胎牛血清诱导NSCs贴壁分化,同时用MOI为5的HCMV AD169株感染NSCs,7d后使用激光共聚焦显微镜免疫荧光方法检测Nestin、神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和HCMV即刻早期蛋白(IE)的表达,计算阳性细胞比率。本实验所培养的细胞(4～6代)95±8%表达Nestin;分化诱导7d后,感染组86±12%细胞表达IE,未感染组和感染组Nestin阳性率分别为50±19%和93±10%(t=6.03,P<0.01),GFAP阳性细胞率分别为81±11%和55±17%(t=3.77,P<0.01)。以上结果表明分化过程中的NSCs是HCMV的容许细胞;HCMV感染可以抑制NSCs的分化。     

长学制医学微生物学实验教学体系构建

针对目前医学微生物学实验教学中的突出问题,从实验内容和实验教学手段等方面入手,探索建立一整套适用于七年制及长学制学生的实验课程教学体系,体现创新教育教学的理念.     

HSV-1感染对人星形胶质瘤细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响

目的:研究单纯疱疹病毒1型(Herpes simplexvires,HSV-1)感染对人星形胶质瘤细胞U251增殖、凋亡和细胞周期的影响.方法:以感染复数(MOI)为5的HSV-1感染体外培养的U251细胞,在感染后24 h、48 h、72 h和96 h用倒置显微镜观察U251细胞的形态改变:用MTT法、流式细胞术观察HSV-1感染对U251细胞增殖、凋亡和细胞周期的影响.结果:①U251细胞在感染24h后开始出现细胞融合,48 h后开始出现典型的细胞病变效应(Cytopathic effect,CPE),72h后超过80%的细胞出现CPE,.96h后细胞大部分死亡.②MTT法显示HSV-1感染U251细胞24 h、48 h、72 h及96 h的U251细胞OD值均低于对照组(P<0.05).③HSV-1感染U251细胞12h后凋亡率与对照组无显著差异(P0.05),感染24h和36h后凋亡率比相应对照组有显著差别(p<0.05).④HSV感染12h、24h和36h后均可引起U251细胞S期细胞增多和G0/G1期细胞减少,24 h后G2/M期细胞比例开始增加.结论:HSV.1能感染体外培养的U251细胞,抑制其增殖,促进其凋亡并影响其细胞周期.     

人巨细胞病毒即刻早期蛋白IE2在Tet-On系统调控下的表达及其抗凋亡作用

即刻早期蛋白IE2是人巨细胞病毒(HCMV)感染后最先表达的蛋白质,具有调节细胞周期和抑制细胞凋亡的作用。但IE2蛋白的表达水平与其抗凋亡活性之间的关系尚不清楚。本实验通过建立Tet-On系统调控下表达HCMVIE2蛋白的细胞株,在不同诱导条件下检测IE2蛋白对细胞凋亡和p53表达的影响。结果发现IE2蛋白能抑制TNF-α诱导的细胞凋亡,其抑制效应与IE2蛋白的表达量相关,而原位杂交结果显示IE2蛋白不影响p53的表达,提示IE2蛋白可能通过多种途径抑制细胞凋亡。     

GST-IL-21融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其活性测定

目的:克隆人白细胞介素21(IL-21)编码区的cDNA,在大肠杆菌中得以表达,并检测其促进人外周血单核细胞(PBMC)增殖的生物学活性。方法:利用基因工程技术,以植物血凝素(PHA)刺激的人扁桃体细胞cDNA文库为模板,经PCR扩增获得IL-21的编码基因,并将其重组于表达载体pGEX4T-2中,转化大肠杆菌DH5α进行诱导表达,纯化得到GST-IL-21重组融合蛋白;MTT法检测其对促进PBMC增殖的功能。结果:获得了IL-21编码区的cDNA克隆;SDS-PAGE显示经IPTG诱导表达的该融合蛋白相对分子质量为41000;纯化后的GST-IL-21融合蛋白在体外具有显著的促进PBMC增殖的作用。结论:GST-IL-21融合蛋白在原核表达系统中可以有效表达,并具有较好的生物学活性。     

SARS冠状病毒S基因序列克隆的构建

构建SARS冠状病毒S基因序列克隆p-SARS-S,作为自行设计、建立的RT-PCR检测方法的阳性对照,并为该基因的表达奠定基础.设计合成了位于病毒基因21 504～22 136位的长633 bp的序列片断作为模板进行PCR扩增;将PCR产物与T-Easy载体连接,经过转化提取重组质粒DNA.对构建的阳性克隆进行PCR、酶切、测序鉴定.对经EcoRⅠ酶切鉴定为阳性的重组表达质粒测序,结果显示插入片段大小、方向、碱基匹配与预期一致.构建的阳性对照克隆p-SARS-S有助于建立严格的SARS病毒基因室内质控措施.     

HCMV IE86对ARPE-19细胞周期的影响

目的:构建真核表达质粒pEGFP-N3-IE2,瞬时转染ARPE-19细胞,探讨其时视网膜色素上皮细胞周期的影响.方法:采用PCR方法从质粒pIEP86AD169扩增出IE2片段,将其定向克隆于pEGFP-N3,构建真核表达质粒pEGFP-N3-IE2,酶切、测序鉴定,脂质体介导瞬时转染ARPE-19细胞,RT-PCR、免疫荧光法分析IE2基因在mRNA和蛋白水平的表达.流式细胞仪检测转染前后细胞周期的变化.结果:成功构建重组质粒pEGFP-N3-IE2,并在被转染细胞中检测到IE2基因的表达;瞬时转染后细胞周期表现为S期细胞比例显著增高.结论:成功构建pEGFP-N3-IE2真核表达质粒,重组质粒能在ARPE-19细胞中顺利表达IE2,IE2基因可以引起ARPE-19细胞的细胞周期S期阻滞.     

长学制医学微生物学实验教学体系构建

针对目前医学微生物学实验教学中的突出问题, 从实验内容和实验教学手段等方面入手,探索建立一整套适用于七年制及长学制学生的实验课程教学体系, 体现创新教育教学的理念。     

汉滩病毒截短S基因重组梭菌载体构建及表达

目的：构建含汉滩病毒截短核蛋白基因的重组质粒,并在口服疫苗载体产气荚膜梭菌中表达。方法：以质粒pGEX-4T-2/SA为模板,PCR扩增汉坦病毒截短核蛋白（SA）基因片断,克隆入穿梭载体pJRC200,构建重组质粒pJRC200-SA,转化E.coliDH5α,酶切鉴定。将pJRC200-SA电穿孔转化产气荚膜梭菌,厌氧培养,促芽孢形成诱导蛋白表达。超声裂解产气荚膜梭菌芽孢,对裂解产物进行SDS-PAGE、Western blotting鉴定。结果：酶切、测序表明,SA基因片段被正确插入pJRC200中,Western blotting分析显示SA蛋白成功表达,并能被肾综合征出血热患者阳性血清特异性识别。结论：汉坦病毒截短核蛋白重组克隆构建成功,并能在产气荚膜梭菌中成功表达,为口服疫苗研发奠定了基础。