山羊TNNT3基因可变剪切及其对骨骼肌细胞分化的作用

【目的】快速骨骼肌肌钙蛋白T（fast skeletal troponin T3,TNNT3）作为肌钙蛋白(troponin, Tn)家族成员,调节横纹肌收缩、参与骨骼肌的生长发育并影响家畜肉质性状。通过获得山羊TNNT3基因的可变剪切体,分析山羊TNNT3基因可变剪切的表达模式及其在肌细胞分化中的作用,深入解析TNNT3基因在山羊骨骼肌生长发育过程中的作用机制。【方法】基于NCBI已公布山羊TNNT3基因（NM_001314210.1）和牛TNNT3基因（XM_010821200）mRNA序列,使用软件Primer Premier 6.0设计引物,以简州大耳羊胚胎期和出生后7个阶段骨骼肌为试验材料,克隆测序获得山羊TNNT3基因的CDS区可变剪切体,利用软件ORF Finder、EditSeq、DNAMAN、ClustalW和MEGA_X_10.1.8等对序列进行生物信息学分析;进一步设计实时荧光定量（real-time PCR,RT-qPCR）及半定量引物,研究TNNT3基因剪切体在7个不同组织（背最长肌（longissimus dorsi muscle,LD）、半膜肌（semimembranosus muscle,SM）、心、肝、脾、肺、肾）和7个发育阶段（胚胎期E75、E90、E105和出生后B3、B45、B150、B300）肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中表达模式;此外,对转录本TNNT3_3进行体外编码能力检测确定其具有编码蛋白的能力,并在山羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells,MuSCs）中过表达,观察细胞形态变化以及检测标志基因的表达变化,研究其对山羊MuSCs分化的作用。【结果】①TNNT3（NM_001314210.1）CDS区全序列主要含有18个外显子,其中外显子16/17相互排斥,转录后单一表达。克隆发现山羊TNNT3基因 5个新转录本（TNNT3_1—5）,其外显子数分别是15、15、20、16、14。②生物信息学分析结果显示山羊TNNT3基因核苷酸序列和氨基酸序列与绵羊、牛、猪等哺乳动物具有很高的一致性,而与鱼类和爬行类动物的一致性较低,说明TNNT3基因序列在哺乳动物高度保守。③TNNT3 mRNA在背最长肌、半膜肌、心、肝、脾、肺、肾7个组织中都有表达,其中在骨骼肌中高度富集(P < 0.01),心脏及肺次之,其余组织中较低;TNNT3 mRNA在背最长肌和半膜肌中的表达始终处于一个动态变化中,胚胎期TNNT3在半膜肌的表达量高于背最长肌（P<0.05）;出生后则背最长肌中高于半膜肌（P<0.05）。④山羊TNNT3基因转录本TNNT3_3重复出现保守的外显子9—11（138bp）,体外翻译实验显示其可编码蛋白且蛋白大小与预期基本相符（37 kD）;相较于对照组,在山羊MuSCs中过表达该转录本使肌分化标志基因Myomaker、MyoG和MyH4 mRNA极显著升高(P < 0.01)。【结论】获得了山羊TNNT3基因具有完整CDS区5个新可变剪切体,TNNT3主要在肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中高表达,在哺乳动物中高度保守且促进成肌分化。初步表明TNNT3基因在动物肌肉生长发育中具有重要的生物学功能。     

山羊PPARα基因克隆、分子特性及组织差异表达分析

试验旨在克隆山羊过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferators-activated receptors-alpha,PPARα）基因的CDS区序列,分析其编码蛋白的结构与功能,并探讨其在山羊不同组织中的表达模式。采用RT-PCR方法扩增并克隆PPARα基因CDS编码区;通过在线软件对其一级结构、二级结构和三级结构进行生物信息学分析;利用基因序列和编码蛋白构建系统发育树,进行系统发育进化分析;采用实时荧光定量PCR方法检测PPARα基因在简州大耳羊心脏、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏和网膜6个组织中的相对表达情况。结果表明,山羊PPARα基因CDS区全长1 413 bp,结构稳定,共编码470个氨基酸。生物信息学分析发现,PPARα蛋白是一种结构较为稳定的带负电的亲水性蛋白,以α-螺旋和无规则卷曲为主,无信号肽和跨膜蛋白,属于膜内蛋白。蛋白序列中总共有49个磷酸化位点,9个糖基化位点。保守结构域中含有明显的DBD区域和LBD区域,蛋白结构高度保守。三级结构预测发现其蛋白结构主要为通过长链卷曲连接的2个明显不同的结构区域,结构均以helix螺旋为主。序列比对结果表明,山羊PPARα氨基酸序列与绵羊和牛的同源性最高。实时荧光定量检测结果表明,PPARα基因在肾脏和肝脏中表达量较高,显著高于其他组织（P < 0.05）;在网膜组织和心脏中中度表达,显著高于肺脏和脾脏（P < 0.05）;在肺脏和脾脏中相对低表达;说明山羊PPARα基因可能与体内脂肪氧化、脂质代谢和抗氧化应激等调控功能有关。试验结果为深入研究PPARα基因在山羊中的生理功能和调控机制奠定了理论基础。     

绵羊瘦素受体基因部分序列测定及其变异位点分析

试验旨在检测绵羊瘦素受体(leptin receptor,LEPR)基因序列突变位点,为进一步分析LEPR基因多态性与绵羊生长性状的关系奠定基础。选用美利奴羊与阿华西羊杂交群体作为试验材料,利用RT-PCR、测序等方法测定了4只绵羊的LEPR基因cDNA部分序列及内含子7序列,同时利用PCR-RFLP分析两个位点在群体(229只)中的多态性。测定出LEPR基因cDNA序列长2608 bp(包含外显子2-16完整序列及外显子1和17的部分序列)和LEPR第7内含子序列全长160 bp,共发现5个核苷酸变异位点,第2外显子中2个(T240C和A279G),第10、14外显子中各1个(A1683G,T2373C),内含子7中1个(1285+A73G),外显子中的4个变异位点均未引起编码氨基酸的改变。在研究群体中,A279G与A1683G中A的频率分别为0.415、0.467,后者处于非平衡状态,GG和AA是主要的单倍型。不同物种间序列一致性分值均比较高,但LEPR mRNA区序列一致性比内含子高,基于LEPR mRNA序列构建的系统发育树更符合实际情况,且可靠性值更高。结果表明,绵羊LEPR基因的保守性较强,突变形式主要是转换,A279G和A1683G可能是突变热点。     

五指山猪皮下脂肪组织lncRNA和mRNA的鉴定与分析

为了鉴定和分析五指山猪背部和腹部皮下脂肪组织中差异表达的长链非编码RNA(long noncoding RNA, lncRNA)和信使RNA(messenger RNA, mRNA),采用RNA-Seq和生物信息学方法对五指山猪皮下脂肪组织中的lncRNA和mRNA进行分析筛选,运用DESeq鉴定背部和腹部皮下脂肪组织中差异表达的lncRNA和mRNA,并对差异表达的lncRNA进行靶基因预测分析。结果显示:在五指山猪皮下脂肪组织中共鉴定出12 875个lncRNA,其中正义型10 155个、反义型278个、内含子型246个、基因间型2 196个;在背部与腹部皮下脂肪间,存在184个差异表达的mRNA,其中前十位分别是ZIC1、ZIC4、HAND2、CCBE1、RPH3A、ISM1、ANXA8、SLITRK4、DSG2、EVPL,存在45个差异表达的lncRNA,其中6个只在背部皮下脂肪中表达、18个只在腹部皮下脂肪中表达;获得差异表达lncRNA的靶基因共109个,包括顺式作用的靶基因和反式作用的靶基因。本试验为进一步研究lncRNA和mRNA调控猪皮下脂肪发育的分子机制提供科学依据。     

绵羊Carwell基因及其QTL的研究进展

家畜的重要经济性状大部分是由微效多基因控制的,少部分是由一个或者几个主效基因控制.随着分子生物学技术的快速发展和动物基因组计划的大力开展,控制动物经济性状的众多主效基因被陆续发现,并在畜牧业发展的过程中起到了重大的经济效益和社会效益.当前,人们消费观念在不断改变,对羊肉营养价值的认知逐渐提高,形成了偏爱高蛋白、低脂肪、风味好的优质羊肉.因此寻找绵羊产肉性能的主效基因和定位其QTL成为动物育种专家的重要研究工作.     

便携式风力灭火机的人机工程学评价

为研究便携式风力灭火机的振动、噪声和质量对操作人员生理和心理负荷的影响,通过试验对便携式风力灭火机(国产6MF-30和日本产HB2302)的把手振动和耳旁噪声进行测试,选取心率和反应时间对便携式风力灭火机进行人机工程学评价。结果表明:6MF-30的振动加速度、耳旁噪声、心率增加比、反应时间均大于HB2302;风力灭火机的耳旁噪声随着振动加速度的增加而增加,振动和噪声共同作用于操作人员,难以区分开,因此,将振动和噪声的综合作用视为一个影响因子,取得了较好的分析效果;质量和振动-噪声对心率增加比有显著影响,对反应时间没有显著影响,质量对心率的影响要大于振动-噪声。建议重新对6MF-30进行设计,重点考虑质量和减振降噪,发动机选择功率适中且质量轻的,前把手选择塑料作为主要材料。      

便携式风力灭火机振动及其沿人体手臂传递特性研究

便携式风力灭火机工作时产生的振动会对操作者的健康造成很大影响,为了对其进行优化设计并给出合理使用建议,对国产林海6MF-30和日本小松HB2302风力灭火机的振动频谱和人体手臂振动传递率进行了对比分析。结果表明:6MF-30与HB2302风力灭火机的振动基频分别为58.5和121.5 Hz,试验测试频谱范围内分别存在5个和2个支配性频率,且基频越大,对操作者影响越小,故应优化6MF-30的结构设计以提高其振动的基频;根据ISO5349—2001标准,在最大功率转速下,操作者使用6MF-30和HB2302风力灭火机的允许受振时间分别为2.29和3.27 a;风力灭火机振动对操作者手臂和肩颈的影响很小,绝大部分能量由手掌和手指吸收,需重点研究针对手部的减振策略。      

山羊IGFBP-2基因的克隆、序列分析及其组织表达

【目的】克隆获得南江黄羊IGFBP-2（Insulin-like growth factor binding protein -2）基因的CDS区全序列,对其进行生物信息学分析,并分析IGFBP-2的mRNA和蛋白组织表达特征,为深入研究该基因在出生后山羊生长和发育过程中的作用以及表达调控提供基础资料。【方法】下载NCBI的GenBank数据库中公布的绵羊（Ovis aries,NM_001009436）和牛（Bos taurus,NM_174555）的IGFBP-2基因的mRNA序列,经序列比对后采用保守区域序列并利用Primer Premier 6.0软件设计克隆引物,经PCR扩增后采用TA克隆技术获取含有阳性克隆子的菌液,送公司测序得到山羊IGFBP-2基因的完整编码区序列,并利用EditSeq、DNAMAN 6.0、MEGA 6.0和ExPASy在线平台等软件对CDS区序列和其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;获得山羊IGFBP-2基因CDS区序列后,利用该序列设计实时荧光定量PCR（Q-PCR）引物,采用Q-PCR和蛋白质免疫印迹杂交（Western blotting）方法检测了IGFBP-2的mRNA和蛋白在出生后南江黄羊不同组织（心脏、肝脏、肺、背最长肌、半膜肌和臂三头肌）和不同发育阶段（3、30、60、90和120 d）的表达情况。【结果】①克隆得到954bp的南江黄羊IGFBP-2基因的CDS区全序列,碱基组成为GC含量69.39%,AT含量30.61%,共编码317个氨基酸残基,预测的山羊IGFBP-2蛋白分子量大小为33.8808 kD,等电点为7.82,二级结构由无规卷曲（68.14%）、α-螺旋（18.30%）和延伸链（13.56%）三种形式组成;蛋白结构域分析发现,IGFBP-2蛋白序列包含保守的IB（IGFBP homologues）和TY（Thyroglobulin type Ι repeats）结构域,IB结构域位于第37-125位氨基酸处,TY结构域位于第250-302位氨基酸处;②磷酸化位点预测发现,IGFBP-2蛋白中存在Ser（5）和Thr（7）共12个磷酸化位点;糖基化位点预测发现,IGFBP-2蛋白序列中存在10个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点;③CDS区序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到98.99%、97.73%、87.12%、78.33%和76.26%;氨基酸序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到99.24%、98.10%、87.07%、70.27%和73.00%;④系统进化树分析发现,山羊IGFBP-2与绵羊和牛的亲缘关系最近;⑤组织表达分析表明,IGFBP-2在肝脏中的mRNA和蛋白的相对表达量均最高(P<0.01),背最长肌次之;在不同发育阶段的肝脏组织中,IGFBP-2 mRNA和蛋白相对表达量均呈现一直上升的趋势;在不同发育阶段的背最长肌组织中,IGFBP-2的mRNA表达水平呈现一种“上升-下降-上升”的波动平衡。【结论】获得了山羊IGFBP-2基因完整的编码区序列和组织表达特征,生物信息学分析发现IGFBP-2基因的编码区序列具有物种间的保守性,肝脏是山羊IGFBP-2 的mRNA和蛋白表达的主要组织,同时在山羊不同发育阶段的肝脏和背最长肌组织中,IGFBP-2基因的mRNA和蛋白表达丰度呈现一定的规律性,表明IGFBP-2基因可能在出生后山羊的早期生长发育过程中发挥着重要的作用。     

桃树萌芽期施肥技术

桃树结果早，寿命短，较苹果、梨等果树耐瘠薄。桃梢生长迅速，枝叶繁茂，果实肥大，对氮素反应敏感。幼树、旺树、初结果树施用氮素过多会引起徒长和延迟结果，氮肥用量要适当控制；成年树因结果多，消耗养分多，必须供给充足的肥料，以防早衰。 桃树对钾肥的需求量大，钾对果