山羊TNNT3基因可变剪切及其对骨骼肌细胞分化的作用

【目的】快速骨骼肌肌钙蛋白T（fast skeletal troponin T3,TNNT3）作为肌钙蛋白(troponin, Tn)家族成员,调节横纹肌收缩、参与骨骼肌的生长发育并影响家畜肉质性状。通过获得山羊TNNT3基因的可变剪切体,分析山羊TNNT3基因可变剪切的表达模式及其在肌细胞分化中的作用,深入解析TNNT3基因在山羊骨骼肌生长发育过程中的作用机制。【方法】基于NCBI已公布山羊TNNT3基因（NM_001314210.1）和牛TNNT3基因（XM_010821200）mRNA序列,使用软件Primer Premier 6.0设计引物,以简州大耳羊胚胎期和出生后7个阶段骨骼肌为试验材料,克隆测序获得山羊TNNT3基因的CDS区可变剪切体,利用软件ORF Finder、EditSeq、DNAMAN、ClustalW和MEGA_X_10.1.8等对序列进行生物信息学分析;进一步设计实时荧光定量（real-time PCR,RT-qPCR）及半定量引物,研究TNNT3基因剪切体在7个不同组织（背最长肌（longissimus dorsi muscle,LD）、半膜肌（semimembranosus muscle,SM）、心、肝、脾、肺、肾）和7个发育阶段（胚胎期E75、E90、E105和出生后B3、B45、B150、B300）肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中表达模式;此外,对转录本TNNT3_3进行体外编码能力检测确定其具有编码蛋白的能力,并在山羊骨骼肌卫星细胞（skeletal muscle satellite cells,MuSCs）中过表达,观察细胞形态变化以及检测标志基因的表达变化,研究其对山羊MuSCs分化的作用。【结果】①TNNT3（NM_001314210.1）CDS区全序列主要含有18个外显子,其中外显子16/17相互排斥,转录后单一表达。克隆发现山羊TNNT3基因 5个新转录本（TNNT3_1—5）,其外显子数分别是15、15、20、16、14。②生物信息学分析结果显示山羊TNNT3基因核苷酸序列和氨基酸序列与绵羊、牛、猪等哺乳动物具有很高的一致性,而与鱼类和爬行类动物的一致性较低,说明TNNT3基因序列在哺乳动物高度保守。③TNNT3 mRNA在背最长肌、半膜肌、心、肝、脾、肺、肾7个组织中都有表达,其中在骨骼肌中高度富集(P < 0.01),心脏及肺次之,其余组织中较低;TNNT3 mRNA在背最长肌和半膜肌中的表达始终处于一个动态变化中,胚胎期TNNT3在半膜肌的表达量高于背最长肌（P<0.05）;出生后则背最长肌中高于半膜肌（P<0.05）。④山羊TNNT3基因转录本TNNT3_3重复出现保守的外显子9—11（138bp）,体外翻译实验显示其可编码蛋白且蛋白大小与预期基本相符（37 kD）;相较于对照组,在山羊MuSCs中过表达该转录本使肌分化标志基因Myomaker、MyoG和MyH4 mRNA极显著升高(P < 0.01)。【结论】获得了山羊TNNT3基因具有完整CDS区5个新可变剪切体,TNNT3主要在肌肉组织（背最长肌和半膜肌）中高表达,在哺乳动物中高度保守且促进成肌分化。初步表明TNNT3基因在动物肌肉生长发育中具有重要的生物学功能。     

山羊PPARα基因克隆、分子特性及组织差异表达分析

试验旨在克隆山羊过氧化物酶体增殖物激活受体α（peroxisome proliferators-activated receptors-alpha,PPARα）基因的CDS区序列,分析其编码蛋白的结构与功能,并探讨其在山羊不同组织中的表达模式。采用RT-PCR方法扩增并克隆PPARα基因CDS编码区;通过在线软件对其一级结构、二级结构和三级结构进行生物信息学分析;利用基因序列和编码蛋白构建系统发育树,进行系统发育进化分析;采用实时荧光定量PCR方法检测PPARα基因在简州大耳羊心脏、肺脏、肝脏、肾脏、脾脏和网膜6个组织中的相对表达情况。结果表明,山羊PPARα基因CDS区全长1 413 bp,结构稳定,共编码470个氨基酸。生物信息学分析发现,PPARα蛋白是一种结构较为稳定的带负电的亲水性蛋白,以α-螺旋和无规则卷曲为主,无信号肽和跨膜蛋白,属于膜内蛋白。蛋白序列中总共有49个磷酸化位点,9个糖基化位点。保守结构域中含有明显的DBD区域和LBD区域,蛋白结构高度保守。三级结构预测发现其蛋白结构主要为通过长链卷曲连接的2个明显不同的结构区域,结构均以helix螺旋为主。序列比对结果表明,山羊PPARα氨基酸序列与绵羊和牛的同源性最高。实时荧光定量检测结果表明,PPARα基因在肾脏和肝脏中表达量较高,显著高于其他组织（P < 0.05）;在网膜组织和心脏中中度表达,显著高于肺脏和脾脏（P < 0.05）;在肺脏和脾脏中相对低表达;说明山羊PPARα基因可能与体内脂肪氧化、脂质代谢和抗氧化应激等调控功能有关。试验结果为深入研究PPARα基因在山羊中的生理功能和调控机制奠定了理论基础。     

绵、山羊毛囊发育与毛发弯曲机制研究进展

毛囊作为唯一的一个终生呈周期性生长的微器官,其生长、代谢都处于一个相对活跃的状态。毛发是由毛囊生长发育后的终末分化细胞构成,是一个持续不断生长的结构。毛发的生长依赖于毛囊结构干细胞特性的分裂、增殖、分化,因此毛发生长的形态变化取决于毛囊结构生长发育的情况。随着研究方法的不断进步与更新,近年来针对毛发弯曲性状分子遗传学层面的研究进展较迅速,一些影响毛囊形态发育和毛发弯曲过程的基因和调控通路相继被发现和鉴定。本文旨在先通过对毛囊结构及其形态发生特点的剖析,进一步对近年来毛囊各细胞层在毛发弯曲产生的影响和特异性调控基因的相关研究进行归纳,绘制出与毛囊发育相关的经典通路和相关调控基因的互作网络,为今后对羊毛弯曲动态现象的分子机理研究提供参考。     

绵羊Carwell基因及其QTL的研究进展

家畜的重要经济性状大部分是由微效多基因控制的,少部分是由一个或者几个主效基因控制.随着分子生物学技术的快速发展和动物基因组计划的大力开展,控制动物经济性状的众多主效基因被陆续发现,并在畜牧业发展的过程中起到了重大的经济效益和社会效益.当前,人们消费观念在不断改变,对羊肉营养价值的认知逐渐提高,形成了偏爱高蛋白、低脂肪、风味好的优质羊肉.因此寻找绵羊产肉性能的主效基因和定位其QTL成为动物育种专家的重要研究工作.     

山羊IGFBP-2基因的克隆、序列分析及其组织表达

【目的】克隆获得南江黄羊IGFBP-2（Insulin-like growth factor binding protein -2）基因的CDS区全序列,对其进行生物信息学分析,并分析IGFBP-2的mRNA和蛋白组织表达特征,为深入研究该基因在出生后山羊生长和发育过程中的作用以及表达调控提供基础资料。【方法】下载NCBI的GenBank数据库中公布的绵羊（Ovis aries,NM_001009436）和牛（Bos taurus,NM_174555）的IGFBP-2基因的mRNA序列,经序列比对后采用保守区域序列并利用Primer Premier 6.0软件设计克隆引物,经PCR扩增后采用TA克隆技术获取含有阳性克隆子的菌液,送公司测序得到山羊IGFBP-2基因的完整编码区序列,并利用EditSeq、DNAMAN 6.0、MEGA 6.0和ExPASy在线平台等软件对CDS区序列和其编码的氨基酸序列进行生物信息学分析;获得山羊IGFBP-2基因CDS区序列后,利用该序列设计实时荧光定量PCR（Q-PCR）引物,采用Q-PCR和蛋白质免疫印迹杂交（Western blotting）方法检测了IGFBP-2的mRNA和蛋白在出生后南江黄羊不同组织（心脏、肝脏、肺、背最长肌、半膜肌和臂三头肌）和不同发育阶段（3、30、60、90和120 d）的表达情况。【结果】①克隆得到954bp的南江黄羊IGFBP-2基因的CDS区全序列,碱基组成为GC含量69.39%,AT含量30.61%,共编码317个氨基酸残基,预测的山羊IGFBP-2蛋白分子量大小为33.8808 kD,等电点为7.82,二级结构由无规卷曲（68.14%）、α-螺旋（18.30%）和延伸链（13.56%）三种形式组成;蛋白结构域分析发现,IGFBP-2蛋白序列包含保守的IB（IGFBP homologues）和TY（Thyroglobulin type Ι repeats）结构域,IB结构域位于第37-125位氨基酸处,TY结构域位于第250-302位氨基酸处;②磷酸化位点预测发现,IGFBP-2蛋白中存在Ser（5）和Thr（7）共12个磷酸化位点;糖基化位点预测发现,IGFBP-2蛋白序列中存在10个N-糖基化位点和2个O-糖基化位点;③CDS区序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到98.99%、97.73%、87.12%、78.33%和76.26%;氨基酸序列相似性比较发现,山羊IGFBP-2与绵羊、牛、猪、人和小鼠的相似性分别达到99.24%、98.10%、87.07%、70.27%和73.00%;④系统进化树分析发现,山羊IGFBP-2与绵羊和牛的亲缘关系最近;⑤组织表达分析表明,IGFBP-2在肝脏中的mRNA和蛋白的相对表达量均最高(P<0.01),背最长肌次之;在不同发育阶段的肝脏组织中,IGFBP-2 mRNA和蛋白相对表达量均呈现一直上升的趋势;在不同发育阶段的背最长肌组织中,IGFBP-2的mRNA表达水平呈现一种“上升-下降-上升”的波动平衡。【结论】获得了山羊IGFBP-2基因完整的编码区序列和组织表达特征,生物信息学分析发现IGFBP-2基因的编码区序列具有物种间的保守性,肝脏是山羊IGFBP-2 的mRNA和蛋白表达的主要组织,同时在山羊不同发育阶段的肝脏和背最长肌组织中,IGFBP-2基因的mRNA和蛋白表达丰度呈现一定的规律性,表明IGFBP-2基因可能在出生后山羊的早期生长发育过程中发挥着重要的作用。     

10个绵羊品种的微卫星DNA多态性研究

本研究利用FAO和ILRI推荐的21个微卫星引物,结合荧光标记PCR,检测了中国9个地方绵羊（Ovisaries）品种和1个外来绵羊品种的遗传多样性。21个微卫星座位均呈现出高度多态,多态性信息含量和杂合度均表明我国地方绵羊品种有着丰富的遗传多样性。本研究共检测到342个等位基因,有效等位基因数在2．1752～9．4997之间,座位平均杂合度在0．5248～0．8551之间,品种平均杂合度在0．633-0．761之间。聚类关系和主成分分析结果与其起源、育成历史及地理分布基本一致。     

藏山羊脂联素基因的克隆与表达分析

为研究脂联素（AdipoQ）基因在藏山羊中的表达模式及相关功能,本试验利用生物信息学和比较基因组学方法克隆得到藏山羊AdipoQ基因序列;半定量RT-PCR和qPCR方法检测AdipoQ基因在成年藏山羊11个不同组织中的表达模式及不同脂肪组织中AdipoQ基因的相对表达量。结果显示,藏山羊AdipoQ基因编码区与牛、猪、人等哺乳动物AdipoQ基因同源性较高;AdipoQ基因在脂肪组织中表达量最高,在肌肉组织和胃中表达量较低,而在其他各组织中未检测到表达;AdipoQ基因在肾周脂肪组织中的表达量高于肠系膜脂肪组织和皮下脂肪组织中的表达量,但差异不显著（P>0.05）。本研究得到藏山羊AdipoQ基因序列、组织表达模式及不同脂肪组织中的相对表达量,为进一步研究藏山羊AdipoQ基因的功能奠定基础。     

数量性状全基因组关联分析中上位效应遗传位点检测方法研究进展

数量性状的表型变异受到大量效应微小的遗传位点和诸多环境因素的共同作用,但在数量性状的遗传研究领域,关于不同遗传位点之间加性效应与上位效应相对重要性的认识却存在着分歧。近年来,伴随着全基因组关联分析在人类及家养动物数量性状研究中的发展,在全基因组关联分析的框架内进行上位效应遗传位点的检测越发受到重视。文章以遗传力失踪问题为出发点,首先综述了标记-QTL连锁分析和GWAS框架下传统上位效应遗传位点的检测方法,然后对基于表型方差同质性检验和广义线性混合模型方法的上位效应统计推断以及混杂因素的处理方法进行了总结与梳理,旨在为数量性状全基因规模上位效应的相关研究提供理论参考。     

IGF1R和IGF2R在南江黄羊不同组织和肌细胞中的表达模式比较

为了探讨IGF1R和IGF2R基因在山羊不同组织及肌细胞中mRNA的表达模式,本研究采用qRT-PCR检测了南江黄羊妊娠期3个阶段(E45、E60和E105)的背最长肌及出生后5个时期(B3、B30、B60、B90和B120)的肌肉组织(背最长肌、臂三头肌)和内脏(心、肝、肺)中IGF1R和IGF2R的mRNA水平,以及骨骼肌卫星细胞(skeletal muscle satellite cells,SMSCs)增殖和分化过程中二者的表达模式。结果表明,在胎儿期的背最长肌中,IGF1R与IGF2R均呈现先上升后下降的表达趋势,其中IGF1R在E45和E60的表达量高于IGF2R(P<0.05,P>0.05),在E105的表达量低于IGF2R(P<0.01)。在出生后阶段,IGF1R在肺中表达量最高,肝中最低;相反,IGF2R在肺中表达量最低,在背最长肌中最高。随着羔羊的发育,IGF1R与IGF2R的表达量在心中呈现上升的趋势,在肝中呈现"下降-上升-下降"的表达变化,而在肺中两者的表达趋势相反(B90前)。在背最长肌和臂三头肌中,IGF1R的表达量呈现持续上升模式(B90前),IGF2R则呈现出"下降-上升-下降"的趋势。此外,IGF1R和IGF2R在SMSCs增殖阶段(24、48和72 h)呈现"下降-上升"的表达模式,分化早期(0～3 d)低表达而后期显著增加(分化5 d,P<0.05),随后下降。本研究获得了IGF1R和IGF2R基因在南江黄羊不同组织及SMSCs中的表达模式,初步揭示IGF1R在山羊肺中的高表达与肝中的低表达对器官的生长和功能维持具有关键作用,IGF1R与IGF2R协同促进其肌肉组织发育和肌细胞的增殖分化。