Twist基因逆转录病毒载体的构建及其诱导正常乳腺上皮细胞发生上皮间质转化

目的 构建Twist基因逆转录病毒载体,研究其对人正常乳腺上皮细胞MCF10A的影响.方法 酶切pcDNA3/myc-Twist获得myc-Twist,克隆到逆转录病毒载体pBABE-puro中,构建重组质粒pB AB E-myc-Twist.通过酶切、测序鉴定Twist基因正确后,在体外将质粒pBABE-myc-Twist和其对照分别与包装质粒pAmpho共同转染人胚肾上皮细胞系293T细胞,进行逆转录病毒的包装,并感染人正常乳腺MCF10A上皮细胞,用嘌呤霉素(puromycin)筛选,获得成功转入Twist的MCF10A-Twist细胞和MCF10A-Vector对照细胞.通过RT-PCR和Western blot法验证Twist细胞在MCF10A-Twist和MCF10A-Vector细胞内的表达.免疫荧光技术和Western blot法检测细胞内上皮间质转化(EMT)标志蛋白的表达.Transwell(R)法检测细胞的迁移和侵袭能力.结果 重组逆转录病毒载体质粒pBABE-myc-Twist经酶切和测序鉴定构建正确;Twist基因被逆转录病毒成功导入MCF10A细胞,并在靶细胞内稳定表达,RT-PCR检测到Twist mRNA在MCF10A-Twist细胞中表达,Western blot法检测发现myc-Twist蛋白在MCF10A-Twist细胞中表达;免疫荧光和Western blot法检测显示在MCF10A-Twist细胞中E-cadherin表达显著下调、vimentin表达明显上调;与MCF10A-Vector细胞相比,Transwell(R)法检测发现MCF10A-Twist细胞迁移和侵袭能力明显增加(P＜0.01).结论 Twist诱导MCF10A细胞发生EMT转化,并促进其迁移和侵袭.     

乳腺癌相关成纤维细胞miRNA表达的检测和分析

目的研究人乳腺癌微环境癌相关成纤维细胞(CAF)与正常成纤维细胞(NF)miRNA表达的差异及其对CAF的生物学功能的影响。方法运用1型胶原酶消化法分别处理临床乳腺癌患者的癌组织和对应癌旁组织标本,原代分离培养CAF和NF细胞;利用免疫荧光法和Western blot法分析CAF和NF细胞成纤维细胞分泌蛋白(FSP)的表达情况,对所分离培养的细胞进行纯度和特性鉴定;利用TranswellTM实验比较CAF与NF细胞的侵袭能力;利用miRNA芯片和芯片结果显著性差异(SAM)分析法分析CAF与NF细胞miRNA表达的差异;对差异miR-205和miR-221,在原代培养的CAF和NF进行实时定量PCR(qRT-PCR)验证;利用多种生物信息学软件预测差异miRNA的靶基因;利用DAVID软件对靶基因进行信号通路富集度分析。利用ELISA检测TGF-β和IL-6信号通路的核心蛋白基质金属蛋白酶1(MMP-1)、MMP-2和MMP-9的表达差异。结果成功分离得到原代培养的CAF与NF细胞,纯度大于95%;与NF细胞相比,CAF细胞的侵袭能力明显增强;miRNA芯片分析结果显示,CAF有10个变化倍数1.5的异常表达miRNA(P0.05),其中3个上调表达(miR-221-5p、miR-31-3p、miR-221-3p),7个下调表达(miR-205、miR-200b、miR-200c、miR-141、miR-101、miR-342-3p、let-7g)。信号通路富集度分析发现,miRNA靶基因与细胞分化、细胞黏附、细胞迁移、细胞增殖、细胞分泌和细胞间相互作用等密切相关,其中,异常表达的miR-200b/c和miR-141等miRNA通过抑制其靶基因,影响TGF-β信号通路、IL-6信号通路,进而影响CAF的侵袭和转移。结论人乳腺癌微环境CAF的miRNA表达谱发生显著变化,CAF细胞中异常表达miRNA可能参与了NF向CAF的转化,并与CAF细胞的增殖、黏附、侵袭、转移有密切关系。     

外周血淋巴细胞染色体分析(摘要)

临床资料本组病人１２６例，男７４例，女５２例；年龄５４ｄ～３５岁。均为来自青岛市各医院优生与遗传咨询门诊的病人。其中智力低下３４例，原发闭经３０例，习惯性流产６２例。采用外周血淋巴细胞培养，染色体常规制片法，Ｇ，Ｃ显带。每例镜下计数１００个中期分列相...     

低氧诱导乳腺癌癌相关成纤维细胞能量代谢重塑细胞模型的构建

目的：构建低氧诱导的乳腺癌癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAF）能量代谢重塑（energy metabolism reprogramming,EMR）细胞模型,为其后续分子机制和生物学功能研究奠定基础。方法：以成对的永生化的乳腺癌癌旁组织来源正常成纤维细胞（normal fibroblasts,NF）和CAF为处理对象,根据[O2]不同,NF和CAF细胞各分为常氧处理组和低氧处理组。不同氧浓度分别处理NF和CAF细胞0、1、3、6、12 h和24 h。葡萄糖消耗实验和乳酸生成实验检测细胞糖酵解水平;线粒体活性检测实验评估细胞氧化磷酸化（oxidative phosphorylation,OP）活性;Western blot实验检测细胞能量代谢相关蛋白包括单羧酸转运子4（monocarboxylate transporters 4,MCT4）、细胞色素氧化酶Ⅳ亚基（cytochrome oxidase Ⅳ subunit,COX Ⅳ）和低氧诱导因子1α亚基（hypoxia inducible factor 1α subunit,HIF1α）的蛋白表达量。结果：低氧与CAF细胞EMR呈剂量效应和时间效应关系,1%[O2]作用24 h为最佳低氧处理条件。与NF常氧组相比,低氧处理（1%[O2]作用24 h）使CAF葡萄糖吸收和乳酸产生能力分别增强2倍和3.1倍,明显抑制其氧化磷酸化活性,使CAF细胞中MCT4和HIF1α蛋白表达量分别上升3.1倍和3.9倍及COX Ⅳ下调90%。结论：低氧（1%[O2]作用24 h）使CAF具有典型的EMR表型。本研究成功构建低氧诱导的乳腺癌CAF细胞EMR模型。     

结直肠癌循环血游离miRs分子诊断标志物研究进展

微小RNAs（microRNAs,miRs）是一类非编码小分子单链RNA,主要在翻译水平负性调控基因表达。近年来研究发现,循环血游离miRs对结直肠癌（colorectal cancer,CRC）具有潜在的诊断作用。CRC患者具有特异性的循环血游离miRs表达谱,其中,miR-18a、miR-21、miR-29a和miR-92a等miRs均具有潜在的CRC诊断价值,而miR-7具有潜在的CRC早期诊断价值。这些研究结果表明,循环血游离miRs有可能成为新的CRC分子诊断标志物。     

高表达ITGB1促进人乳腺上皮MCF10A细胞EMT及迁移

目的探讨ITGB1基因过表达对人乳腺上皮MCF10A细胞迁移和侵袭的影响。方法构建重组质粒p BABEpuro-myc-ITGB1,在人胚肾上皮细胞系293T细胞中包装反转录病毒,转染人乳腺上皮MCF10A细胞系,构建ITGB1基因过表达的稳定细胞系;实验设空白对照组(MCF10A)、阴性对照组(MCF10A-vector)和ITGB1基因过表达组(MCF10A-ITGB1);经嘌呤霉素筛选后,实时荧光定量PCR和蛋白质印迹法检测ITGB1 mRNA及蛋白的表达;Transwell迁移和侵袭实验分别检测细胞株迁移和侵袭能力;蛋白质印迹法进一步检测上皮间质转换(EMT)相关蛋白E-cadherin、vimentin、fibronectin、N-cadherin以及ITGB1下游ILK、p-FAK和FAK蛋白的表达。结果成功构建ITGB1基因稳定过表达人乳腺上皮MCF10A细胞系;ITGB1基因过表达组(MCF10A-ITGB1)与空白对照组(MCF10A)和阴性对照组(MCF10A-vector)细胞相比,迁移能力(P0.05)和侵袭能力(P0.01)显著增强;EMT相关蛋白E-cadherin显著下调(P0.05),vimentin、fibronectin、N-cadherin以及ITGB1下游ILK,p-FAK蛋白显著上调(P0.05)。结论在人乳腺上皮MCF10A细胞中,过表达ITGB1基因诱导细胞EMT并促进其迁移和侵袭。     

MCF-7细胞他莫昔芬耐药过程中F-actin细胞骨架的重构促进细胞迁移

目的研究人乳腺癌细胞MCF-7获得他莫昔芬(tamoxifen,TAM)耐药过程中发生的肌动蛋白细胞骨架重构及其对细胞迁移能力的影响,并探讨相关分子机制。方法采用高浓度短时间4-羟基他莫昔芬(4-hydroxytamoxifen,OHT)冲击法诱导人乳腺癌MCF-7/TAM耐药细胞株(Tam-R)。运用FITC标记的鬼笔环肽染色观察纤维状肌动蛋白(F-actin)动态变化,免疫荧光分析E-钙粘蛋白在野生型MCF-7细胞(MCF-7W)及Tam-R细胞中的表达及分布,pull-down和Westernblot检测小GTP酶Rac1活性,Transwell细胞迁移实验评估F-actin骨架重构对Tam-R细胞迁移能力的影响。结果 MCF-7W细胞中F-actin富集于毗邻细胞膜周边,呈典型鹅卵石形态,E-钙粘蛋白分布与F-actin相似,可在毗邻细胞膜周边形成完整的黏附连接;而Tam-R细胞中F-actin纤维出现板状伪足和应力纤维两种异常形态,细胞外围不能通过E-cadherin与周围细胞形成完整的黏附连接。在Tam-R细胞中,PI3K抑制剂Wortmannin(WM)可抑制OHT引起的F-actin骨架重构、Rac1的活化和细胞迁移(P<0.05),而ERK1/2抑制剂U0126对OHT引起的F-actin骨架重构无明显影响。结论 OHT可能激活PI3K,促进Rac1活化,通过诱导F-actin骨架重构促进Tam-R细胞迁移。     

肿瘤相关成纤维细胞中G蛋白偶联雌激素受体胞浆转位介导的旁分泌对乳腺癌细胞生长的影响

目的:探讨乳腺癌微环境肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)中G蛋白偶联雌激素受体(GPER)活化对成纤维细胞生长因子2(FGF2)的表达调控作用及其诱导的旁分泌对肿瘤细胞生长的影响。方法:免疫荧光法检测单独培养及与ER+乳腺癌MCF-7与ER-乳腺癌MDA-MB-468细胞共培养条件下CAFs和GPER突变型CAFs中GPER的表达定位。用荧光定量PCR法与ELISA法分别检测17-β雌二醇(E2)或GPER特异性激动剂G1处理后单独培养或与乳腺癌细胞共培养的CAFs细胞以及与乳腺癌细胞共培养的GPER突变型CAFs的FGF2mRNA表达和FGF2分泌水平;流式细胞术与CCK-8法检测与CAFs共培养的两种乳腺癌细胞经E2和G1处理后细胞增殖能力的变化,以及FGF2中和抗体的干预作用。结果:单独培养下,GPER定位于CAFs及GPER突变型CAFs的细胞核,与两种乳腺癌细胞共培养后,CAFs细胞中GPER出现明显胞浆转位,而GPER突变型CAFs无此现象。E2和G1处理后,共培养条件下的CAFs中FGF2的mRNA表达及上清液中的FGF2含量均明显增加(均P0.05),但单独培养的CAFs与共培养条件下的GPER突变型CAFs无上述变化(均P0.05)。E2和G1处理后,共培养条件下的两种乳腺癌细胞的增殖能力均明显增强(均P0.05),但该作用均被FGF2中和抗体取消。结论:在乳腺癌微环境下,CAFs中GPER有明显的胞浆转位,这有利于雌激素/GPER/FGF2通路的活化,从而可能促进在乳腺癌的进展。     

c-Ski癌基因对肿瘤相关成纤维细胞活化的影响

目的：研究癌基因c-Ski对乳腺癌相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts,CAFs）活化的影响。方法：应用基因重组技术,将c-Ski基因克隆到载体pBABE-puro,转染至永生化的正常乳腺成纤维细胞（normal fibroblasts,NFs）,嘌呤霉素药物筛选稳定转染细胞株;Western blot检测转染后c-Ski、α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin,α-SMA）和成纤维细胞活化蛋白（fibroblast activation protein,FAP）的表达;通过MTT法、流式细胞术、细胞划痕实验及Transwell细胞侵袭实验研究转染前、后成纤维细胞增殖、迁移、侵袭能力的差异;收集细胞上清制备条件培养基,用Transwell细胞侵袭实验分析转染后成纤维细胞对MD-MB-231细胞侵袭能力的影响。结果：成功构建重组质粒pBABE-puro-Ski;Western blot检测结果显示,pBABE-puro-Ski转染组细胞中c-Ski、α-SMA和FAP表达明显高于空白对照组细胞（P=0.000,P=0.001,P=0.002）;MTT法结果显示转染组细胞增殖能力高于空白对照组细胞（P=0.011）;转染组细胞的S期含量（38.58±1.28）明显高于空载体组（25.05±0.52）和空白对照组（26.01±0.86）,差异具有统计学意义（P=0.000）;细胞划痕实验及Transwell细胞侵袭实验结果表明转染组细胞的迁移、侵袭能力均高于空载体组和空白对照组细胞;转染组细胞条件培养基能明显促进MD-MB-231细胞的侵袭能力。结论：c-Ski癌基因表达上调能促进NFs活化为CAFs,并进一步促进乳腺癌细胞MD-MB-231的侵袭能力。