协同刺激分子CD28在结核杆菌抗原体外激活人外周血γδT细胞中的作用

目的 :为了探讨CD2 8协同刺激分子在结核杆菌 (Mtb)低分子多肽抗原体外激活人外周血γδ T细胞中的作用。方法 :采用激发型抗CD2 8单抗模拟第二信号 ,Mtb低分子多肽抗原作为刺激原 ,对纯化的人外周血T细胞进行体外刺激和培养 ;用流式细胞仪检测γδ T细胞上CD2 8分子的表达、γδ T细胞的增殖效应及活化的γδ T细胞上CD6 9分子的表达。结果 :人外周血γδ T细胞中有 5 0 %左右表达CD2 8分子 ;抗CD2 8单抗协同Mtb抗原可刺激γδ T细胞的活化和增殖 ;但抗CD2 8单抗或Mtb抗原单独刺激则无作用。活化的γδ T细胞表面表达CD6 9分子。结论 :Mtb抗原在选择性活化人外周血γδ T细胞时需要第二信号的参与 ;CD2 8在Mtb抗原激活γδ T细胞时可提供协同刺激信号 ;CD6 9可作为γδ T细胞的早期活化标志。     

4-1BB(CD137)配体在几种肿瘤细胞株上的表达

目的：研究4—1BBL在几种人肿瘤细胞株上的表达。方法：用RT—PCR及法检测肿瘤细胞内4—lBBL mRNA水平的表达；用流式细胞仪检测肿瘤细胞膜表面4—1BBL的表达。结果：4—1BBL在Jurkat细胞株上高表达(98．97％)，在HL-60和K562上表达较低(分别为24．77％和19．23％)，而在HL-29细胞株上基本不表达(2．13％)。结论：4—1BBL在不同肿瘤细胞株表达水平不同。     

采用IL－6cDNA控针检测人IL－6基因表达

采用缺口平移技术对ＩＬ—６ｃＤＮＡ进行了生物素和同位素标记，证明两种标记的ＩＬ－６ｃＤＮＡ（３０ｎｇ／ｍｌ）均可检出低至５ｐｇ的同源ＤＮＡ，而模拟探针（５００μｇ／ｍｌ）对高达１００ｎｇ的同源序列无此反应。应用ＩＬ－６ｃＤＮＡ对富含ＩＬ－６ｍＲＮＡ的标本进行斑点杂交或Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交，证明人参三醇皂甙促进了淋巴细胞ＩＬ—６基因表达（４倍），人胎脾单个核细胞、人胎脑组织匀浆和人胎胰岛细胞内均含有高浓度ＩＬ—６ｍＲＮＡ。     

纯化的结核杆菌多肽抗原刺激人γδT细胞的效应分析

目的：探讨从结核杆菌多肽抗原(Mtb-Ag)纯化的多肽(C主肽)对人新鲜外周血γδT细胞的促增殖效应以及对已活化扩增的T细胞再次刺激的激活效应。方法：采用不同剂量的C主肽体外刺激健康人外周血PBMC，培养10天时经流式细胞仪检测细胞表型；另外以γδT细胞活化标志分子CD69的表达为指标，分析C主肽对已被Mtb-Ag激活扩增13天的γδT细胞再次刺激的激活效应。同时以MTT法检测C主肽的再刺激对已活化扩增的γδT细胞的促增殖活性。结果：结核杆菌C主肽对人新鲜的γδT细胞具有显著扩增效应；当C主肽再刺激已经活化的γδT细胞时，可使其显著表达CD69分子，同时对γδT细胞具有显著促增殖活性。结论：结核杆菌C主肽可能是Mtb-Ag发挥特异性激活人γδT细胞的有效成分。     

蛋白激酶Cθ信号途径在结核分枝杆菌抗原激活人γδT细胞增殖和分化中的作用

目的 研究蛋白激酶Cθ(protein kinase Cθ,PKCθ)信号途径在结核分枝杆菌抗原(Mycobacterium tuberculosis antigen,Mtb-Ag)激活人γδT细胞增殖和分化中的作用.方法 健康人外周血单个核细胞(PBMC)用Mtb-Ag和IL-2优势刺激和扩增γδT细胞,或预先用5.0μmol/L Rottlerin(楸毒素)预处理,培养不同时间后,用流式细胞术(FCM)检测γδT细胞表面活化分子和细胞因子表达;同时采用活体染料羧基荧光素乙酰乙酸(CFSE)标记细胞,流式细胞术分析Mtb-Ag刺激γδT细胞后的增殖和各子代细胞百分率.结果 PBMC经Mtb-Ag刺激后3d,γδT细胞CD69和CD25表达分别为46.2%和45.6%,而Rotderin预处理显著地抑制了CD69和CD25表达(P＜0.01);PBMC经Mtb-Ag激活培养5、10和15d,培养扩增细胞中的γδT细胞比例分别为9.6%、54.6%和82.4%,其中第5天已有少部分γδT细胞发生增殖,第10天和第15天时几乎全部γδT细胞分裂都在6代以上,用Rottlerin预处理,显著抑制了γδT细胞增殖反应,但在培养第10天后仍有少部分γδT细胞发生增殖反应;同时在培养第7天、14天和21天,用PMA(佛波酯)+Ionomycin(离子霉素)再刺激后,产生IFN-γ的γδT细胞均在80%左右;培养21d时,有2.6%的γδT细胞表达IL-4.在Rottlerin预处理组产生TH1型细胞因子IFN-γ的γδT细胞均显著减少(P＜0.05),而γδT细胞表达TH2型细胞因子IL-4则几乎完全抑制(P＜0.01).结论 PKCθ信号途径在Mtb-Ag刺激γδT细胞的增殖和分化中均起重要作用.     

PKC途径和P13K在人γδT细胞分泌IL-2与IFN-γ中的作用

目的 研究信号转导中的蛋白激酶C(PKC)途径与磷酸肌醇3激酶(P13K)在人外周血γδT细胞分泌Th1型细胞因子IL-2与IFN-γ中的作用.方法 人PBMC先用P13K抑制剂Ly29400Z、PKC抑制剂Rottlerin或NT-κB抑制剂TPCK分别预处理1h,再加入结核杆菌低分子量多肽抗原(Mtb-Ag)和rhIL-2刺激3 d,最后用低浓度PMA Ionomycin短时再刺激后检测γδT细胞IL-2和IFN-T分泌;并同时检测,αβT细胞作为对照.结果 无抑制剂的对照组γδT和αβT细胞中分泌IL-2的比例分别为44.5%和15.2%,分泌IFN-γ的比例分别为51.1%和10.7%;Ly294002、Rottlerin、TPCK组分泌IL-2的γδT和αβT细胞均显著减少(P＜0.05或P＜0.01),后二组分泌IFN-γ的78T和αβT细胞亦显著减少(P＜0.05或P＜0.01);但Ly294002组分泌IFN-γ的γδT和αβT细胞反而上升至77.2%和22.3%(P＜0.01).结论 PKC途径活化促进人γδT细胞分泌IL-2与IFN-γ;PDK亦促进人γδT细胞分泌IL-2但在其分泌IFN-γ中起负向作用.     

MtbAK细胞与CD3AK、LAK细胞体外增殖和杀瘤活性比较

目的:比较结核杆菌抗原激活的杀伤细胞(Mtb AK)、CD3AK及LAK细胞的体外增殖能力和杀瘤活性.方法:分别用结核杆菌抗原(Mtb-Ag)、CD3 mAb和rIL-2刺激人外周血单个核细胞(PBMC),在含rIL-2的RPMI 1640培养液中诱导扩增MtbAk、CD3AK和LAK细胞,用计数法动态观察细胞扩增情况,在流式细胞仪上分析MtbAK中的γδ T细胞比例,以MTT法检测三种扩增细胞对肿瘤细胞的细胞毒活性.结果:与CD3AK和LAK细胞相比,MtbAK细胞具有更强的增殖能力和较高的细胞毒活性.结论:MtbAK细胞在体外更易于扩增,具有较高的杀瘤活性,有可能应用于肿瘤患者的临床过继免疫治疗.     

结核杆菌抗原活化的γδT细胞的抗肿瘤活性

目的：探讨经结核杆菌抗原特异性活化的γδＴ细胞的抗肿瘤活性。方法：结核杆菌抗原（Ｍｔｂ－Ａｇ）、ＩＬ－２、ＰＨＡ做为刺激原,活化正常人外周血单个核细胞（ＰＢＭＣ）,用流式细胞仪分析活化后淋巴细胞的表型,用ＭＴＴ法测定活化淋巴细胞的杀伤活性。结果：Ｍｔｂ体外活化ＰＢＭＣ可于１８天获得大量淋巴细胞,且γδＴ细胞占有较高比例,对肿瘤细胞有较高杀伤活性。结论：用Ｍｔｂ为刺激原可获得大量γδＴ细胞,且在体外     

结核分枝杆菌耐热抗原激活的人γδT细胞Th2极性分化特征以及T-bet/GATA-3对分化的调控作用

目的研究结核杆菌耐热抗原(MTB-HAg)激活的人外周血γδT细胞Th2极性分化特点和表达于T细胞中的T盒(T-bet)和GATA结合蛋白3(GATA-3)转录因子的调控作用。方法用MTB-HAg刺激人外周血单个核细胞(PBMC)获得MTB-HAg激活的T细胞(MTBAT),分别在中性条件和Th2极化条件培养后,再经10 ng/m L佛波醇酯(PMA)、500 ng/m L离子霉素(ionomycin)和2.5μmol/L莫能菌素(monensin)刺激6 h,四色荧光抗体染色流式细胞术检测γδT细胞和αβT细胞内细胞因子γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)的表达。流式细胞术分选28 d MTBAT中的γδT细胞和CD4+T细胞,反转录PCR(RT-PCR)检测T-bet和GATA-3 mRNA的表达。结果在中性条件和Th2极化条件下培养的MTBAT中,γδT细胞一直优势表达IFN-γ,而Th2极化条件下,随培养时间增加IFN-γ+αβT细胞百分率显著下降。与中性条件培养比较,Th2极化条件下MTBAT培养28 d,Th0型(IFN-γ+IL-4+)γδT细胞显著增加;而Th2型(IFN-γ-IL-4+)αβT细胞显著增加。RT-PCR结果显示,Th2极化的γδT细胞仍高表达T-bet mRNA,而在CD4+T细胞T-bet mRNA表达被显著下调;同时,GATA-3 mRNA在γδT细胞和CD4+T细胞的表达均显著上调。结论 Th2极化条件下,大部分γδT细胞仍为Th1型,仅部分极性分化为Th0型细胞;Th2极性分化的γδT细胞转录因子T-bet和GATA-3未表现出交互调节功能。     

TGF-β1诱导的新生儿脐带血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞增殖动力学研究

目的：探讨转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）诱导的新生儿脐带血CD8^＋CD25^＋调节性T细胞增殖活性。方法：新生儿脐带血单个核细胞经羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯（carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE）标记后,加入TGF-β1,同时用CD3mAb激活和IL-2培养扩增。培养第4、6、8天收集细胞,用流式细胞术检测活化增殖后的CD4^＋CD25^＋、CD8^＋T细胞增殖动力学变化。结果：培养后第6、8天,实验组CD4^＋CD25^＋T细胞增殖指数分别为11.52、23.04,高于对照组CD4^＋CD25^＋T细胞（6.68,10.46）及实验组CD8^＋T细胞（4.23,5.43）。培养后第8天,实验组CD4^＋CD25^＋T细胞第8代到第10代所占的比例为52.74%,在各代中以第8代所占比例最高,而对照组CD4^＋CD25^＋T细胞第8代到第10代所占的比例为36.26%;实验组CD8^＋T细胞第8代到第10代所占的比例为13.54%,在各代中所占比例最高的为第2代,而对照组CD4^＋T细胞第8代到第10代所占的比例为29.44%。结论：TGF-β1诱导的新生儿脐带血CD4^＋CD25^＋调节性T细胞增殖活性明显强于CD8^＋T细胞。