新生大鼠原代小胶质细胞分离培养方法的改良

目的研究改良体外小胶质细胞分离培养的方法及效果。传统法存在动物用量大、成本高且细胞培养时间长等局限。方法结合消化试剂组合和手摇震荡法培养分离小胶质细胞;同时采用Iba-1免疫荧光法进行细胞鉴定和纯度分析,台盼蓝染料法进行活力检测以及脂多糖刺激比较不同状态的小胶质细胞。结果改良法可在4 d内稳定获得小胶质细胞 1. 0×10~6个/60 mm培养皿,纯度≥98%,活力 98%,较传统法在动物用量、总成本和培养时间分别减少了2、3. 2、1. 5倍。结论改良法可减少动物用量、降低成本,缩短细胞培养时间;为研究小胶质细胞的生物学功能和中枢神经系统疾病机制建立了一种稳定、简便、高效的细胞模型。     

再程序化脂肪源性干细胞的制备及体外定向分化为神经元的实验研究

目的制备再程序化脂肪源性干细胞以及探索诱导其定向分化为神经元的方法。方法体外培养脂肪来源干细胞(ADSCs),取纯化、鉴定过的第3代ADSCs接种于24孔板中并分A,B,C三组:A组为带有绿色荧光基因(GFP)的慢病毒载体介导Neurogenin2(Ngn2)基因转染的ADSCs,制备再程序化脂肪干细胞;B组为带有GFP的空载体病毒转染的ADSCs;C组为未进行慢病毒介导基因转染的ADSCs;转基因7d后加入含细胞生长因子诱导培养基诱导分化15d。光镜下观察各组细胞形态变化以及免疫荧光研究各组ADSCs诱导后定向分化为神经元的差异。结果与B组和C组相比,A组ADSCs转基因后再经诱导分化15d后绝大部分细胞类似神经元,胞体呈梭形或椭圆形,有两个或三个突起伸出,细胞表达神经丝蛋白NF、神经元特异性蛋白NeuN及神经元特异性烯醇化酯酶NSE比例大大提高。B组与C组的神经元分化效率,无显著差异,P>0.05。结论慢病毒介导Neurogenin2基因体外转染ADSCs可以制备出再程序化脂肪源性干细胞,诱导后具有更强的定向分化为神经元的能力。     

再程序化脂肪干细胞移植治疗大鼠脊髓损伤的机制

目的制备再程序化脂肪干细胞(ADSCs),并在体研究再程序化ADSCs移植入大鼠脊髓损伤模型后促进损伤脊髓神经功能恢复的作用和机制。方法体外培养、纯化和鉴定大鼠ADSCs,并利用慢病毒包装神经元生成素2(Ngn2)基因转染ADSCs制备再程序化干细胞。体内实验将48只雌性SD大鼠随机分成3组:SCI对照(A)组、单纯ADSCs移植(B)组和Ngn2-ADSCs移植(C)组。采用BBB评分评价大鼠运动功能,并通过HE染色、免疫组化和免疫荧光等方法检测脊髓组织学改变和相关蛋白的表达水平,进而观察实验动物脊髓功能恢复情况。结果 Ngn2-ADSCs移植组在运动功能评分、胶质瘢痕的形成、脊髓损伤后病理变化和分泌神经营养因子BDNF和VEGF蛋白含量明显优于其他组。结论 Ngn2-ADSCs移植后能有效地存活,并分化为神经细胞,抑制胶质瘢痕形成,减小脊髓损伤空洞,增加BDNF和VEGF表达,最终促进SCI大鼠的运动功能恢复,较单纯应用ADSCs能更好地促进SCI修复。     

皮肤源性再程序化神经干细胞的制备以及定向分化为神经细胞的体外研究

目的:研究制备皮肤源性再程序化神经干细胞以及诱导其定向分化为神经细胞的可行性.方法:体外培养大鼠皮肤来源前体细胞(skin-derived precursors,SKPs)并纯化、鉴定,用含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒载体系统作为基因转染工具.将第3代SKPs分3组:A组为慢病毒载体介导neurogenin2(...     

重编程多能干细胞构建组织工程化神经移植修复脑损伤的实验研究

目的利用重编程多能干细胞构建组织工程化神经,探讨组织工程化神经移植治疗大鼠脑损伤的作用和机制。方法采用改良Feeney自由落体法对80只雄性SD大鼠建立脑创伤模型后,将其随机分成4组:损伤对照组(A组),单纯组织工程细胞支架组(B组),单纯脂肪干细胞组(C组)和组织工程化神经组(D组)。移植后采用动物神经缺损体征评分、Morris水迷宫试验,以及脑组织病理检查评估大鼠神经功能的修复状况。结果重编程多能干细胞可显著表达神经元标记物(Neu N)。移植后2周,组织工程化神经组大鼠的神经缺损体征评分明显低于其他各组,并且Morris水迷宫试验平均逃避潜伏期明显缩短,穿越平台次数明显增多。移植后4周,病理检查结果示,组织工程化神经组大鼠的脑组织无明显空洞和软化灶,同时出现典型的神经细胞样形态学改变。结论重编程多能干细胞构建的组织工程化神经能够明显改善脑损伤大鼠的神经功能。     

再程序化脂肪干细胞体外定向神经分化效率和机制

目的 探讨再程序化脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)体外定向神经分化的效率和机制. 方法 体外培养大鼠ADSCs并纯化、鉴定,将第3代ADSCs分为三组:未进行慢病毒介导基因转染ADSCs组(空白组);不含神经元生成素-2(neurogenin-2,Ngn2)基因慢病毒空载体转染ADSCs组(空病毒组);慢病毒载体介导Ngn2基因转染ADSCs组(Ngn2组);各组细胞均用含细胞生长因子的诱导培养基诱导15 d.免疫荧光检测各组细胞神经元特异性蛋白(NeuN)阳性表达以观察神经元分化效率;Western blot检测各组细胞Mash1、Hes1、Dll1蛋白表达水平的差异,探索分化机制. 结果 诱导培养基诱导15 d后,Ngn2组、空病毒组、空白组阳性表达NeuN分别为90.12％、45.34％、40.26％,各组比较差异均有统计学意义(P＜0.01).Western blot 结果显示,Ngn2组Dll1蛋白表达水平明显高于空病毒组和空白组(P＜0.01),Mash1、Hes1蛋白表达水平明显低于空病毒组和空白组(P＜0.01);空病毒组和空白组Dll1、Mash1和Hes1蛋白表达差异均无统计学意义(P＞0.05). 结论 再程序化ADSCs诱导后神经元分化的比例较单纯ADSCs提高近99％,再程序化ADSCs定向分化神经元机制可能是通过上调Dll1蛋白水平,同时下调Mash1、Hes1蛋白水平,抑制notch信号通路,从而促进细胞的定向神经分化.     

再程序化星形胶质细胞的制备及体外定向分化为神经元的研究

目的探讨再程序化星形胶质细胞制备并在体外诱导其分化为神经元。方法在体外培养大鼠脑皮质来源星形胶质细胞(astrocyte),随后将提纯、鉴定过的第三代星形胶质细胞接种于12孔培养皿中,并分为A、B、C 3组。其中A组为带有绿色荧光蛋白(GFP)的慢病毒载体介导neurogenin2(Ngn2)基因转染的星形胶质细胞,制备再程序化星形胶质细胞;B组为带有GFP基因的空载体病毒转染的星形胶质细胞;C组为未进行慢病毒介导基因转染的星形胶质细胞;转基因1周后加入含细胞生长因子诱导培养基诱导分化15 d,光镜下观察各组细胞形态变化以及定向神经元分化的差异。结果 A组星形胶质细胞转基因后再诱导15 d,很大部分细胞形态呈神经元样改变,胞体呈梭形或椭圆形,有多个突起伸出且突起较长,表达神经元核蛋白(Neu N)、神经丝蛋白(NF)及神经元特异性烯醇化酶(NSE)的比例大大提高,相比B组及C组,差异有统计学意义(均P0.05);而B组与C组神经元分化比例的差异无统计学意义(P0.05)。结论慢病毒介导Ngn2基因体外转染星形胶质细胞可制备出再程序化星形胶质细胞,诱导后具有更强的向神经元定向分化能力。