一种原代小胶质细胞培养与纯化方法的改良

目的建立一种简易高效的新生大鼠小胶质细胞的原代培养和纯化方法,提高小胶质细胞的产量以及纯度。方法在传统Miriam Mecha的混合胶质细胞培养方法的基础上通过改良操作,混合培养小胶质细胞,并分别采用手拍法、摇床法以及温和胰酶消化法,纯化小胶质细胞,通过差速贴壁进一步纯化细胞。荧光显微镜下标记小胶质细胞的特异性标记物Iba1、CD11b/c进行鉴定。结果 (1)分离培养第1天小胶质细胞呈不规则圆形,折光不均匀,继续培养3~5 d,小胶质细胞逐渐出现单极或多极突起,7 d时部分细胞转为静止状态,呈分枝状;(2)纯化后小胶质细胞多呈静息状态,细胞免疫荧光CD11b/c、Iba1双阳性;(3)不同纯化方法细胞免疫荧光并计数显示:手拍法纯化小胶质细胞,细胞阳性率(96%)明显高于胰酶消化法(90%,P0.05),前者细胞产量明显高于摇床法(P0.05)。结论通过改良传统Miriam Mecha的混合小胶质细胞的培养和纯化方法,可以提高小胶质细胞产量以及纯度。     

一种高产量的小胶质细胞培养及其鉴定方法

目的建立一种简易高产量的原代小胶质细胞体外纯化培养方法.方法在小胶质细胞原代培养过程中以McCarthy等的经典培养方法为基础,通过提高初次接种密度,减少细胞离心过滤过程,进行不换液的营养缺失培养等重要改进,并使用低浓度胰酶-EDTA消化法分离纯化小胶质细胞,使用MAC-1抗体免疫化学染色标记.结果取得了高纯度和高产量的小胶质细胞.结论小胶质细胞培养过程中联合使用营养缺失法和低浓度胰酶-EDTA消化法分离纯化可有效提高培养产量.     

3种小胶质细胞培养方法的比较

目的:建立一种小鼠小胶质细胞的简便高产量的原代培养方法。方法:在常规的神经胶质混合培养后,分别采用MeCarthy-Gulian法、营养丧失法、营养丧失+温和消化法三种方法进行小胶质细胞的分离纯化,通过细胞计数来了解比较培养细胞的产量,针对细胞表面的小胶质细胞的标志性抗原MAC-1进行免疫组织化学染色,观察细胞形态和激活状态,计算培养细胞纯度。结果:营养丧失十温和消化法细胞产量最高,三种方法的细胞培养形态、激活状态、纯度没有显著差异。结论:营养丧失和胰酶-EDTA温和消化均较经典的McCarthy-Gulian法产量高,2种方法结合起来的营养丧失+温和消化法是一种新的简便易行高产量的小胶质细胞培养方法。     

小胶质细胞和少突胶质细胞前体的培养和鉴定

目的 探讨新生大鼠脑组织小胶质细胞(MG)和少突胶质细胞(OL)前体的分离和体外培养方法 . 方法 取新生2 d SD大鼠脑组织,体外原代培养混合胶质细胞7 d后,分别采用"改良振荡伴差速贴壁"法和"营养缺失伴振荡"法纯化培养MG和OL前体,并分别应用免疫荧光染色异凝集素-B4(IB4)和OL前体标记物(O4)进行鉴定.结果 混合胶质细胞培养7 d后呈明显三层增长,其中MG位于上层,星型胶质细胞位于底层,两者之间为2型少突星型(O2A)祖细胞.纯化培养后OL前体胞体呈小圆形,有双极或三极突起,MG则以阿米巴形、圆形居多,或边缘呈毛刺状.免疫荧光染色IB4显示绿色荧光,MG纯度达到90%以上.免疫荧光染色O4显示棕黄色荧光,OL前体纯度达到95%以上. 结论 采用"改良振荡伴差速贴壁"法以及"营养缺失伴振荡"法分别成功获取大量纯度高、活力好的MG和OL前体.     

一种改进的星形胶质细胞原代培养方法

目的改进大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养,旨在通过较简便的方法获得高纯度形态典型的星形胶质细胞,为研究星形胶质细胞的生物学作用提供实验模型。方法以新生大鼠为星形胶质细胞来源,利用不同规格的吸头相互叠套,逐步机械吹打,使细胞分散,制备单细胞悬液;获得的单细胞悬液用差速黏附处理去除成纤维细胞,原代培养14d后,恒温振荡法去除小胶质细胞等杂质细胞;胶质细胞原纤维酸性蛋白(GFAP)和S100β免疫荧光共染色,鉴定细胞纯度。结果这种改进的星形胶质细胞培养方法 ,分离培养出星形胶质细胞,阳性率达95%以上。结论采用机械吹打方法建立原代星形胶质细胞培养体系,是一种比较简便、值得推广的可用于体外细胞培养研究工作的有效方法。     

缺氧对原代培养大鼠小胶质细胞生物学功能的影响

目的 通过观察缺氧环境中原代培养大鼠小胶质细胞生物学功能的变化,进一步探讨活化态小胶质细胞在缺血缺氧性脑病中的作用机制.方法 通过建立原代培养的SD大鼠小胶质细胞的缺氧模型,观察细胞形态学及其增殖活力的改变.利用ELSIA检测TNF-α、IL-1β含量改变,利用荧光探针DAF- FMDA检测iNOS的相对活性.结果 在缺氧旱期,原代培养小胶质细胞增殖在缺氧早期开始,增殖活力于缺氧3h时最高,其后随着缺氧时间的延长而降低.在缺氧早期小胶质细胞培养上清液内TNF-α、IL- 1β含量以及iNOS相对活性等多种神经毒性因子的表达水平增加.结论 缺氧可诱使小胶质细胞生物学功能改变,呈现应激活化状态,主要表现在细胞生长增殖活力先上调后下降,神经毒性因子表达水平显著增高等方面.     

星形胶质细胞源性因子对神经干细胞分化的实验研究

目的探讨星形胶质细胞源性因子对神经干细胞分化的影响。方法分离和培养新生大鼠脑组织的神经干细胞;采用差速贴壁法和振荡法分离纯化星形胶质细胞,用免疫细胞化学染色法,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)标记星形胶质细胞,进行细胞的纯度鉴定;将星形胶质细胞和神经干细胞在互不接触的情况下进行共培养,免疫荧光法观察神经干细胞分化后神经元特异性烯醇化酶(NSE)、GFAP和酪氨酸羟化酶(TH)的表达。结果纯化的星形胶质细胞GFAP抗体标记阳性,细胞纯度达98%;星形胶质细胞与神经干细胞共培养时,神经干细胞贴壁分化加快,NSE阳性细胞及TH阳性细胞明显多于对照组(P<0·05)。结论星形胶质细胞源性因子可快速诱导神经干细胞向神经元细胞、包括多巴胺神经元细胞分化,提示星形胶质细胞支持神经元发生。     

8-9个月SD大鼠小胶质细胞的纯化分离培养

目的建立培养8-9个月SD大鼠大脑皮层小胶质细胞的方法。方法以McCarthy的方法为基础,并加以改进,采用振摇结合贴壁分离法纯化小胶质细胞;CD11b免疫细胞化学染色对纯化的小胶质细胞纯度进行鉴定;相差显微镜下进行细胞形态观察和细胞计数;CCK-8比色法检测纯化的小胶质细胞在不同时间点的活力和增殖。结果培养的8-9个月SD大鼠大脑皮层小胶质细胞,纯度达到95%,培养过程中未出现明显的增殖。结论8-9个月SD大鼠大脑皮层的小胶质细胞在体外亦可成功培养,为小胶质细胞在老年疾病中的研究奠定了基础的。     

脑血管平滑肌细胞分离培养与鉴定

目的分离培养脑血管平滑肌细胞.方法用组织块干涸法分离培养平滑肌细胞并进行光镜观察和免疫组化鉴定.结果平滑肌细胞传代培养后经台盼蓝排斥实验,细胞的成活率达95%,免疫组化鉴定培养细胞中的平滑肌细胞的纯度为97%.平滑肌细胞呈梭形,可单层生长;也可多层重叠呈"谷、峰”状生长.结论平滑肌细胞培养能为研究脑血管疾病提供良好的细胞.     

溶血磷脂酸诱导原代培养的小鼠小胶质细胞的凋亡

目的 观察不同浓度的溶血磷脂酸对原代培养小鼠小胶质细胞凋亡的干预与调控作用。方法 分离新生小鼠的大脑小胶质细胞进行原代培养，用CD11b抗原抗体免疫组化染色法鉴定纯度，在不同浓度溶血磷脂酸作用下以MTT法检测细胞增殖率，流式细胞术检测凋亡率。结果 原代培养的小胶质细胞纯度大于95％，低浓度溶血磷脂酸（0．001～20μmol／L）对小胶质细胞有激活增殖的作用；在浓度为20-80μmol／L之间时随着溶血磷脂酸浓度的增加，凋亡率逐渐升高；与对照组比较均具有显著性差异（P〈0．05）。结论 低浓度的LPA可激活小胶质细胞，促使其增殖，而高浓度的溶血磷脂酸可诱导小胶质细胞凋亡。     

大鼠脊髓少突胶质前体细胞的培养与鉴定方法

目的 探讨大鼠脊髓少突胶质前体细胞（OPCs）的分离纯化及诱导分化方法.方法 取出生后3d内SD大鼠脊髓,采用0.125％胰蛋白酶消化获取原代混合胶质细胞,培养10 d左右在37℃恒温摇床采取180 r/min摇速振摇并差速贴壁40 min获得纯化的OPCs;取纯化后培养3d的OPCs免疫荧光鉴定细胞纯度或诱导分化.结果 采用胰蛋白酶消化法获取原代混合胶质细胞、振摇并差速贴壁法分离纯化能够得到纯度较高的OPCs,折光性强,呈双极或三极形态,免疫荧光染色显示95％细胞表达A2B5和NG2（OPCs标志物）,经诱导分化后表达O4及MBP（少突胶质细胞标志物）.结论 采用振摇差速贴壁法可从大鼠脊髓中分离纯化获得高纯度的OPCs,获得的OPCs体外生长稳定,经诱导可分化为成熟的少突胶质细胞.     

新生大鼠大脑少突胶质细胞系的分离纯化和定向分化培养

在体外培养条件下获取纯度较高的少突胶质细胞系细胞并探索其分化规律。新生大鼠大脑皮质原代混合胶质细胞培养７－９d或１４－１５d,利用振荡和差速贴壁分离纯化少突胶质前体细胞,再进行无血清化学条件培养基培养。原代培养７－９d时细胞分层形成,Ｏ－２Ａ组细胞（oligodendrocyte/type 2 astrocyte progenitor)分散位于星形质细胞单层上,振荡分离后纯化率大于９５％,分离后的Ｏ－２Ａ祖细胞神经节苷脂ＧＤ３抗体阳性,无血清培养３d后分化为“蜘蛛状”细胞,半乳糖脑脂抗体阳性。原代培养１４－１５d时,星形胶质细胞层上出现葡萄样前Ｏ－２Ａ祖细胞和少量师星形胶质细胞培养时细胞完全分层的出现是振荡分离Ｏ－２Ａ祖细胞的适宜条件,分离纯化的Ｏ－２Ａ祖细胞可自动分化为少突胶质细胞。     

一种从新鲜脑胶质瘤标本中分离小胶质细胞的改良方法

目的 建立一种快速有效从脑胶质瘤组织中分离小胶质细胞的改良方法.方法 采用密度梯度离心法联合磁珠分选法从脑胶质瘤组织中分离小胶质细胞.用流式细胞术、Western blot 和细胞免疫荧光检测细胞纯度,流式检测免疫表型,趋化及吞噬实验检测其生物学功能;对从不同级别胶质瘤组织分离的小胶质细胞产量进行定量分析.结果 收获细胞具有小胶质细胞典型形态及Iba1染色阳性,纯度可达(95.1±4.2)％;流式细胞术检测显示其表达CD11b、HLA-DR等,并对ATP 的趋化作用呈浓度依赖性,且在体外具有良好的吞噬乳胶微球(latex beads)的功能.此外,每克胶质瘤组织分离小胶质细胞细胞产量:低级别组(n=4),(4.0±0.5) ×105;高级别组(n=8),(4.3±0.4) ×105,两组差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用改良的分离小胶质细胞方法能从新鲜脑胶质瘤组织中快速获得大量高纯度小胶质细胞.     

少突胶质Ⅱ型星形祖细胞纯化培养与鉴定

目的:探索新生大鼠脑皮质少突胶质Ⅱ型星形祖细胞(OP)的纯化及鉴定.方法:分离、培养新生大鼠皮质混合胶质细胞,采用改良的振荡分离纯化法获取OP细胞,并进行诱导分化和免疫组化鉴定.结果:用该方法获取的OP细胞A2B5和Nestin免疫染色为双阳性,细胞纯度可达90%以上,且具有分化为星形胶质细胞和少突胶质细胞的双分化潜能...     

溶血磷脂酸对原代培养的小鼠小胶质细胞的活化作用

目的探讨溶血磷脂酸(Iysophosphatidic acid,LPA)对原代培养的小鼠小胶质细胞的活化作用。方法神经胶质细胞的混合培养及小胶质细胞的分离、纯化,用免疫化学染色鉴定小胶质细胞,用MTT法检测不同浓度的LPA对小胶质细胞数量的影响,用ELISA法检测不同浓度LPA活化小胶质细胞后所释放的TNF-α。结果免疫组化显示原代培养的小胶质细胞纯度高,达95%;LPA在0.001~20μmol/L范围内小胶质细胞的数量呈剂量依赖性的递增趋势,与对照组差异显著(P<0.01),而在大于40μmol/L的浓度范围内小胶质细胞数量逐渐减少;LPA在0.001~100μmol/L浓度范围内促进小胶质细胞分泌TNF-α,其量比对照组显著增高(P<0.05),其中在30μmol/L范围内小胶质细胞分泌TNF-α的量与LPA浓度呈正比,而大于50μmol/L时TNF-α的分泌量减少,各浓度组间差异显著(P<0.05),而在48h作用组每个浓度段所刺激分泌的TNF-α量与24h作用组相应浓度段比较无显著差异。结论在一定浓度范围内LPA对原代培养的小鼠小胶质细胞有活化作用,分泌炎性因子TNF-α增多,从而可以推论脑部病理情况下增高的LPA可能通过活化小胶质细胞在介导脑损伤的病理过程中发挥了一定的作用。     

小鼠脊髓原代星形胶质细胞培养方法的建立

目的获得纯度较高的脊髓源性星形胶质细胞。方法采用小鼠脊髓神经胶质细胞的原代培养和传代培养。无菌条件下取生后1～3dICR(Institute of Cancer Research)小鼠的脊髓,剪碎后胰酶分次消化,结合机械吹打使细胞分散,制成单细胞悬液,接种于无底物黏附的玻璃培养瓶中,置37℃,5%CO2培养箱中培养。培养液为DMEM/F12混合培养液。培养9～12d待细胞达到80%～90%融合后进行摇床纯化,舍弃含脱落细胞的细胞悬液,以去除少突胶质和小胶质细胞,继续培养,待细胞铺满瓶底后传代,并对传代细胞进行形态观察和星形胶质细胞的免疫荧光鉴定,GFAP免疫细胞化学染色阳性细胞可高达98%。结果通过恒温振荡和传代后得到了形态典型,含量较高的脊髓源性星形胶质细胞。结论用无底物贴附,恒温振荡和传代方法可获得高纯度脊髓源性星形胶质细胞。     

白藜芦醇对脑创伤后小胶质细胞激活的影响

目的检测白藜芦醇治疗后大鼠脑损伤区激活小胶质细胞的形态及数量改变,以探讨白藜芦醇的脑保护机制。方法健康雄性SD大鼠75只,随机分为创伤组、对照组和治疗组,每组分伤后3、12、24、48和72h共5个时间点,各时间点每组5只动物,用改良Feeney自由落体法致伤动物。治疗组予以白藜芦醇(50mg/kg体重)腹腔注射,对照组给予等量生理盐水,创伤组未给予药物处理。分别于伤后各时间点麻醉动物,取伤区脑组织,用抗OX-42免疫组化法检测小胶质细胞变化。结果伤后早期小胶质细胞即被激活,在不同时间点小胶质细胞形态不同:正常大鼠脑内小胶质细胞处于静息状态,细胞形态不清晰;伤后3h,OX-42浅染,小胶质细胞形态可见;伤后12h,小胶质细胞反应明显,OX-42深染,细胞形态清楚;伤后24h,小胶质细胞反应达高峰,细胞形态清晰,突起上可见到小棘;48h以后,反应减弱,OX-42浅染,细胞数量减少。治疗组小胶质细胞数量明显减少(P<0.05),创伤组与对照组无明显差异(P>0.05)。结论伤后不同时间点激活小胶质细胞的形态和数目不同,白藜芦醇能抑制小胶质细胞的激活,具有脑保护作用。     

神经干细胞对老化小胶质细胞存活及JNK信号通路的调控作用

目的 研究神经干细胞对老化小胶质细胞存活及c-Jun氨基末端激酶(JNK)磷酸化蛋白(p-JNK)表达的调控作用. 方法 原代培养的小胶质细胞和神经干细胞分别取自12～18个月龄的ICR小鼠及孕12.5 d的ICR小鼠,特异性标记物IB4染色、免疫荧光检测nestin的表达进行鉴定.利用插入式共培养系统将传代后稳定的小胶质细胞与神经干细胞(1∶4)共培养,噻唑蓝(MTT)法检测共培养前后细胞增殖能力的变化;用20 ng/mL.JNK抑制剂Sp600125预处理小胶质细胞4h,再加入神经干细胞共培养3d,Western blotting检测共培养前后小胶质细胞p-JNK的相对表达量的变化. 结果 原代培养的小胶质细胞呈贴壁生长,折光性强,特异性标记物IB4染色显示细胞纯度在80％以上.神经干细胞nestin染色呈阳性;共培养组细胞的增殖能力显著高于单纯小胶质细胞和神经干细胞,差异有统计学意义(P＜0.05);共培养的小胶质细胞+神经干细胞组小胶质细胞的p-JNK的相对表达量高于小胶质细胞组,Sp600125共培养组p-JNK的相对表达量高于单纯Sp600125刺激组,差异均有统计学意义(P＜0.05). 结论 神经干细胞可以通过激活JNK信号通路促进老化小胶质细胞的存活.     

CYP2C19基因多态性与奥氮平所致窦性心动过速 关系的研究

目的 探讨脂多糖（LPS）对星形胶质细胞凋亡和活力的影响,建立活化星形胶质细胞模 型。方法 取刚出生1 d 大鼠（P1）大脑进行细胞培养、传代,获得高纯度星形胶质细胞,接种于培养板, 进行LPS（1 μg/ml）干预,设立对照,继续培养24～72 h。按实验要求,细胞凋亡检测分组：LPS-24 h 组、 对照-24 h 组、LPS-72 h 组、对照-72 h 组,使用TUNNEL 法检测各组星形胶质细胞凋亡,并计算凋亡 率;细胞活力检测分组：LPS-0 h组、LPS-24 h组、LPS-72 h组,使用MTT法测定各组星形胶质细胞活力; LPS 干预分组：LPS 干预组和对照组,星形胶质细胞行GFAP免疫组化染色。结果 LPS-24 h 组星形胶 质细胞凋亡率为（7.00±2.23）%,对照-24 h 组为（3.26±1.22）%,两组比较差异无统计学意义（P ＞ 0.05）; LPS-72 h 组星形胶质细胞凋亡率为（36.40±5.32）%、对照-72 h 组为（4.00±1.59）%,两组比较差异有统 计学意义（P＜ 0.05）;LPS-0 h组星形胶质细胞活力为（100.23±5.34）%,LPS-24 h组星形胶质细胞活力为 （91.42±9.88）%,LPS-72 h 组星形胶质细胞活力为（51.21±4.58）%,LPS-72 h 组与其余两组比较差异有 统计学意义（P＜ 0.05）。LPS 干预24 h,星形胶质细胞增生、肥大,突起增多。结论 LPS（1 μg/ml）干预 24 h,星形胶质细胞没有出现明显细胞凋亡和下降的细胞活力,但是形态上出现活化特征,建立了一种 星形胶质细胞活化模型。     

芍药苷对Aβ_(1-42)诱导的小胶质细胞炎性反应和趋化性的影响

目的探讨芍药苷(PF)对β-淀粉样蛋白(Aβ)_(1-42)诱导的小胶质细胞炎性反应和趋化性的影响。方法原代培养大鼠小胶质细胞,分别用0、5、25、50μmol/LPF预处理细胞后,采用CCK-8法和LDH法检测细胞毒性。将培养的细胞分为空白对照组(正常培养基)、阳性对照组(Aβ_(1-42)处理细胞)和实验组(PF+Aβ_(1-42)处理细胞)。采用ELISA法检测各组肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-6(IL-6)和趋化因子配体1(CXCL1)、趋化因子配体2(CCL2)的表达水平。采用Transwell小室进行小胶质细胞体外趋化实验,观察各组细胞趋化迁移情况。结论培养大鼠原代小胶质细胞纯度达90%以上,CCK-8法和LDH法测定均显示PF对小胶质细胞无明显细胞毒作用(均P0.05)。PF可抑制Aβ_(1-42)诱导的小胶质细胞分泌促炎性介质TNF-α、IL-1β、IL-6和趋化因子CXCL1、CCL2(均P0.01)。同时,PF可抑制小胶质细胞向Aβ_(1-42)的趋化(均P0.05)。结论 PF可抑制Aβ_(1-42)诱导的啮齿动物小胶质细胞生成促炎性介质和趋化因子,并抑制小胶质细胞向Aβ_(1-42)趋化迁移,提示PF可能为阿尔茨海默病的治疗提供新的契机。