家禽屠宰场微生物菌群结构及大肠杆菌耐药性评估

家禽屠宰场的水体、地面和屠宰器械表面微生物对鸡肉微生物交叉污染有重要的影响。本研究的主要目的是分析家禽屠宰场水体、地面和与鸡肉接触的屠宰器械表面的细菌结构及其耐药基因携带状况,并从中分离大肠杆菌进行耐药性评估和肠杆菌基因间重复共有序列-聚合酶链式反应（enterobacterial repetitive intergenic consensus polymerase chain reaction,ERIC-PCR）分型分析。在浙江省某大型屠宰场的挂禽间、宰杀沥血间、浸烫脱羽间、净膛间、预冷间、包装间、冷藏间、内脏间区域采集水体,并用无菌纱布擦拭各区域的地面和器械表面采集微生物,基于16S rRNA V3～V4的Illumina高通量测序方法分析其菌群结构多样性,并从中分离大肠杆菌,分别用PCR对总细菌和大肠杆菌进行9大类耐药基因的检测分析和大肠杆菌的ERIC-PCR分型研究。结果表明：屠宰场不同区域水体、地面和屠宰器械表面微生物均以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）为主;优势菌属为不动杆菌属（Acinetobacter）、链球菌属（Streptococcus）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）等一些腐败菌属与致病菌属。屠宰场不同区域的水体、地面和屠宰器械表面存在的耐药基因种类较多,共检测到21 种耐药基因分布在这些样品中,其中sulI、sulII、blaTEM、aadA1、floR、tetA、ereA和qnrS等8 种耐药基因检出率达88.9%以上,与从中分离的大肠杆菌耐药基因检出情况吻合度较低,这表明还存在其他携带耐药基因的菌株,此外分离的大肠杆菌菌株多重耐药现象严重。ERIC-PCR分型结果表明,大肠杆菌可以沿屠宰生产链进行克隆传播。本实验将为探究屠宰环境微生物与鸡肉污染微生物之间的关系提供理论参考。     

杨梅采后贮藏温度和包装方式对表面沙门氏菌的影响及预测模型构建

为比较不同温度、包装方式的杨梅表面沙门氏菌数量变化情况,建立细菌生长/衰亡模型,测定了4,16,25,33℃条件和普通塑料袋包装、保鲜膜包装方式的杨梅表面沙门氏菌生长/衰亡数据;选用Logistic模型为初级模型,拟合不同温度和不同包装方式的杨梅中沙门氏菌生长/衰亡曲线。结果显示,冷藏(4℃)可有效抑制甚至减少细菌数量;低温通风贮藏(16℃)可在一定时间内抑制细菌繁殖,贮藏时间小于30 h;夏季高温条件(33℃)下未见细菌增殖迟滞期,细菌繁殖速度快,风险值得关注。低温贮藏(4,16℃)时不同包装方式对细菌生长/衰亡无显著影响。33℃条件下保鲜膜能有效减缓细菌生长。根据模型评价参数adj-R~2、RMSE,A_f,B_f等对模型进行内部和外部验证,根据Logistic模型进行细菌数量预测。本研究结果可用于杨梅采后沙门氏菌污染控制,为微生物定量风险评估提供重要信息。     

基于MMR缺陷的高频突变食源性沙门氏菌环丙沙星耐药机制

目的：通过研究甲基导向错配修复系统（methyl-directed mismatch repair,MMR）主要调控基因缺陷对食源性沙门氏菌高频突变子突变频率和环丙沙星药敏性的影响,揭示其调控机制。方法：采用萘啶酮酸和利福平平板测定90 株食源性沙门氏菌高频突变子的突变频率;聚合酶链式反应结合DNA测序法检测耐药基因突变;琼脂稀释法测定环丙沙星对沙门氏菌高频突变子的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration,MIC）,确定MMR缺陷与沙门氏菌高频突变子突变频率、MIC及耐药基因间的关系;通过电转化法将野生mutS、mutH、mutL和uvrD基因分别转入高频突变子103D2,采用实时聚合酶链式反应法测定野生型基因转入前后103D2耐药相关基因表达差异,分析MMR基因缺陷对沙门氏菌高频突变子环丙沙星耐药性的影响及调控机制。结果：90 株沙门氏菌高频突变子中共有89 株对环丙沙星耐药,49 株MutS编码基因发生突变（MutS－）,且相较于MutS非突变株,在MutS突变株中GyrA（67.3%）及ParC（87.8%）蛋白突变检出率更高。103D2转入野生型mutS、mutH、mutL 及uvrD基因质粒后,103D2:P-mutS突变频率显著下降,103D2:P-mutL和103D2:P-uvrD突变频率极显著下降。4 株互补菌株中marA基因显著下调,marR、tolC（除103D2:P-uvrD外）基因上调,降低103D2对环丙沙星耐药性。结论：MMR缺陷可通过影响外排泵和膜编码基因marA、marR和tolC的表达改变对沙门氏菌高频突变子的耐药性及突变频率产生影响。     

采样方法对冷鲜鸡表面细菌DNA提取及高通量测序结果的影响

目的:比较涂抹法和冲洗法对冷鲜鸡表面细菌DNA提取及高通量测序结果的影响。方法:将4只冷鲜鸡对半分开,分别采用涂抹法和冲洗法采集其表面微生物,提取基因组DNA,对细菌16S rRNA基因V3~V4区进行聚合酶链式反应扩增,通过Illumina Hiseq测序平台对扩增产物进行高通量测序,使用QIIME等软件对测序序列进行分析统计。结果:两种方法采集的样品在细菌基因组DNA提取、菌群丰富度、多样性及菌群结构等方面均无显著差异(P0.05)。高通量测序结果表明,冷鲜鸡表面细菌菌群主要分布于7个门,10个属。变形菌门为优势菌门,占70%以上;希瓦氏菌属、假单胞菌属、不动杆菌属、嗜冷杆菌属和环丝菌属为优势菌属,分别占10%~20%。结论:两种采样方法对冷鲜鸡表面细菌DNA提取及高通量测序没有明显影响,但冲洗法比涂抹法简单易行,且不易发生二次污染,因此更具有实用性。本实验同时也为冷鲜鸡表面细菌的研究提供了数据资料。     

人工神经网络在鸡胸肉预冷清洗环节中沙门氏菌污染率的预测

为实现对鸡胸肉预冷清洗环节的沙门氏菌污染率的预测,采用响应面试验设计收集数据,建立以初始污染水平、初始污染率、次氯酸钠(NaClO)浓度为输入值,鸡胸肉预冷清洗环节的沙门氏菌污染率为输出值的广义回归神经网络模型(General Regression Neural Network model,GRNN),预测鸡胸肉预冷清洗环节的沙门氏菌污染率变化,并用训练集拟合,测试集评估模型的预测效果。结果显示,鸡胸肉预冷清洗环节的沙门氏菌污染率随初始污染水平、初始污染率的升高而显著增加,相反随NaClO浓度的升高而呈下降趋势(P<0.05)。练后的GRNN模型的r值和SEP值分别为0.93和10.8%,拟合良好。模型对新数据预测的误差较小(SEP=13%),表明GRNN模型可较准确的预测鸡胸肉预冷清洗环节的沙门氏菌污染率。本研究建立的模型可用于鸡胸肉预冷清洗环节沙门氏菌污染率的预测,为微生物定量风险评估提供重要信息。     

高效液相色谱-三重四级杆质谱联用法检测荷斯坦和水牛原料乳中喹诺酮残留

目的建立高效液相色谱-三重四级杆质谱联用法检测我国南方地区荷斯坦和水牛原料乳中喹诺酮类抗生素类残留的分析方法。方法采集南方地区15个荷斯坦牧场和15个水牛牧场的120份原料乳,采用高效液相色谱-三重四级杆质谱联用法检测其中的喹诺酮类抗生素残留情况。结果检出限和回收率分别为0.05~0.25μg/L和88.2%~109.2%。水牛乳中喹诺酮类抗生素残留检出率为8.06%,荷斯坦牛乳中抗生素残留率为6.89%。结论该方法检测牛乳中喹诺酮类结果准确可靠,南方地区的荷斯坦牛乳和水牛乳喹诺酮类残留量与国内外相比程度较低,原料乳总体上处于安全范围。     

高效液相色谱-三重四级杆质谱联用法检测荷斯坦和水牛原料乳中磺胺类药物残留

目的分析目前我国南方地区荷斯坦原料乳和水牛原料乳中磺胺类药物的残留情况。方法采集浙江和广西地区荷斯坦牛牧场和水牛牧场的120份原料乳,采用高效液相色谱-三重四级杆质谱联用法检测其中的磺胺类药物残留。结果方法的检出限和回收率分别为0.05~0.10μg/L和73.2%~108.3%。水牛乳中磺胺类药物的残留量低于6.67μg/L,荷斯坦牛乳中磺胺类药物的残留量低于7.88μg/L。结论高效液相色谱-三重四级杆质谱联用法检测牛乳中磺胺类药物残留的结果准确可靠,我国南方地区的荷斯坦原料乳和水牛原料乳总体上处于安全范围。     

家禽定点屠宰场不同屠宰区域空气的微生物结构

为了解家禽屠宰场空气中微生物分布情况及其结构特点,在浙江选择一家禽定点屠宰场,以菌落总数为指标,比较分析屠宰前和屠宰后各屠宰区域空气沉降微生物的数量,并提取微生物DNA作为模板,经聚合酶链式反应扩增细菌16S rRNA基因的V3～V4区,利用高通量测序技术分析其菌群结构。结果发现家禽屠宰场的不同屠宰区域空气沉降微生物数量有所差异,同时屠宰后微生物数量比屠宰前有所增加,特别是在屠宰后挂禽间菌落总数比屠宰前高出71%。高通量测序显示屠宰前和屠宰后不同屠宰区域空气沉降菌多样性、菌群结构、相对丰度等方面均无显著性差异（P＞0.05）,主要分布于6 个门,优势菌门为厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）和放线菌门（Actinobacteria）,总的相对丰度在84%以上。在属的水平上,葡萄球菌属（Staphylococcus）和不动细菌属（Acinetobacter）为优势菌属,分别占36.90%和13%（在前10 个属中）,此外,在前35 个属中,葡萄球菌属（Staphylococcus）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）和埃希菌属（Escherichia）等条件致病菌属分别占33.75%、4.65%和0.90%。由此说明屠宰场不同屠宰区域沉降菌数量存在一定差异,各屠宰区域均分布有一定数量的条件致病菌,研究为鸡肉微生物污染的溯源和完善家禽屠宰场卫生管理提供科学依据。     

鸡肉源沙门氏菌血清型、药敏性及部分耐药基因研究

目的:研究432株分离于陕西省杨凌及周边城市零售鸡肉中沙门氏菌的血清型分布、药敏性及其与(氟)喹诺酮类抗菌药物抗性相关耐药基因的流行状况。方法:按照玻片凝集法鉴定血清型,使用临床和实验室标准协会推荐的琼脂稀释法测定沙门氏菌的药敏性,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)方法确定沙门氏菌中与(氟)喹诺酮类抗生素耐药相关基因。结果:432株沙门氏菌中除36株血清型未定外,其余396株沙门氏菌共涵盖37个血清型,其中鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium,检出率17.93%)、汤普森沙门氏菌(Salmonella thompsons,检出率12.88%)、埃森沙门氏菌(Salmonella essen,检出率8.84%)和婴儿沙门氏菌(Salmonellainfants,检出率6.57%)等血清型比较常见。沙门氏菌对磺胺异噁唑(耐药率89.81%)耐药最为普遍,对磺胺甲噁唑、萘啶酮酸、四环素、氨苄西林、氯霉素和阿莫西林-克拉维酸等抗生素的耐药率均在50%以上。aac(6’)-Ib-cr基因检出率(16.67%)最高,qnr B、qnr S和qnr A的检出率分别为10.19%、6.71%和1.62%,且该4种基因在不同血清型菌株中分布不同。菌株携带qnr和aac(6’)-Ib-cr基因越多,对(氟)喹诺酮类和氨基糖苷类协同耐药性越强。结论:陕西省杨凌及周边城市零售鸡肉源沙门氏菌的血清型种类繁多,耐药比较普遍。