多重实时荧光定量PCR分析转基因烟草外源基因拷贝数

[目的]采用多重实时荧光定量PCR方法在一个反应内同时检测转基因烟草中插入外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的拷贝数。[方法]将转基因阳性参照烟草基因组DNA经梯度稀释,通过多重荧光定量PCR反应同时获得烟草内源参照基因NR、外源基因35S、NOS、NPT Ⅱ的相关性标准曲线方程,将待测株系外源基因的Ct值代入标准曲线方程后估算其拷贝数。[结果]获得了上述4个基因的标准曲线,其R2均接近于1,相关性较高。在检测的六个转基因株系中初筛到3株3个外源基因均为单拷贝的株系。[结论]可使用该方法对转基因烟草外源基因插入拷贝数进行估算,为获得稳定遗传材料提供初筛依据。      

烟草白粉病抗性基因型的多重PCR检测体系及其在回交育种中的应用

为提高烟草白粉病隐性抗病基因（感病基因）NtMLO1（M1）和NtMLO2（M2）在分子标记辅助选择育种中基因型的选择效率,根据已报道的M1和M2突变基因序列,设计4对单基因特异性引物,组成2个双重PCR反应体系,分别用于同时扩增M1和M2突变型或M1和M2野生型等位基因。结果表明,建立的2个双重PCR体系扩增的特异性片段与单重PCR体系扩增的片段完全吻合,突变基因纯合体只在突变基因多重PCR体系中产生191和306 bp的特异性片段,野生基因纯合体只在野生基因多重PCR体系中产生437和652 bp的特异性片段,杂合体在2个反应体系中均有特异性片段。利用该体系可经过1次或2次PCR扩增准确检测出回交转育过程中回交或自交后代M1和M2的基因型,加快抗病品种育种进程。      

烟草糖基转移酶基因NtGT5a的克隆及原核表达

为揭示烟草糖基转移酶的活性及生物学功能,从烟草栽培品种中克隆了烟草糖基转移酶基因NtGT5a,基于GenBank的烟草糖基转移酶基因NtGT5a的核苷酸序列(GenBank登录号AB176523),设计并合成特异性引物,以红花大金元叶片总RNA为模板,通过RT-PCR方法获得了烟草糖基转移酶基因NtGT5a的cDNA片段。序列分析表明,该基因编码区为1458 bp,编码485个氨基酸残基,推测的蛋白分子量为54.21 kDa,理论等电点为5.41。通过构建重组表达载体pCold-SUMO-NtGT5a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),在15Ⅲ下经0.2 mmol/L IPTG诱导22 h表达产生了SUMO-NtGT5a重组蛋白。重组蛋白部分以包涵体形式存在,部分以可溶性蛋白形式存在。将重组蛋白的可溶性组分经过Ni-NTA柱层析纯化和凝胶过滤层析,用SUMO蛋白酶切除SUMO标签,再用镍柱纯化获得了高纯度的NtGT5重组蛋白。     

GASA基因超家族新成员——烟草抗菌肽基因的克隆及序列分析

抗菌肽可以增强植物对病原微生物的抵抗能力,本研究利用生物信息学方法,获得了烟草品种K326的3种抗菌肽cDNA序列(NtSN1a、NtSN16和NtSN2a),并对其进行了序列分析.结果表明,3种抗茵肽cDNA序列均具有完整的开放读码框,NtSNIa和NtSNIb均编码88个氨基酸,NtSN2a编码104个氨基酸.对推导的氨基酸序列分析发现,它们都具有典型的GASA基因超家族保守结构域,属于GASA基因超家族成员.系统进化分析表明,NtSN1a和NtSN16与马铃薯抗菌肽snaking-1聚为一类,NtSN2a与马铃薯抗菌肽snaking-2聚为一类.这些结果为进一步研究抗菌肽基因的抑菌效应,比较其在烟草抗病防御反应中的作用奠定了基础.     

双向等位基因特异性PCR技术在烟草SNP分型中的应用

为提高抗PVY烟草品种的分子育种效率,本研究针对抗病种质资源半坤村晒烟中隐性抗病基因eIF4E1的SNP位点G149C建立一种简单快速的双向等位基因特异性PCR (Bi-directional PCR amplification of specific alleles,Bi-PASA)检测方法,并对该检测方法的特异性、准确度及实际应用效果进行验证。结果表明,建立的Bi-PASA检测方法能够在一个PCR反应中有效区分eIF4E1基因G149C位点3种基因型:野生型GG、杂合突变型GC、纯合突变型CC。利用Bi-PASA检测方法可以对K326×半坤村晒烟F₂分离群体的基因型进行有效鉴别,且鉴定结果与普通的等位基因特异性PCR (allele-specific PCR,AS-PCR)以及直接测序法的鉴定结果一致。综上所述,本研究建立的Bi-PASA检测方法特异性强、准确度高、操作简便,可更好地应用于eIF4E1基因的分子标记辅助育种。     

烤烟新品种贵烟5号的选育及特征特性

烤烟新品种贵烟5号是以自育品系2009-203(PVH06×NC729)为母本,南江3号为父本杂交,经系谱法选育而成,2020年通过全国烟草品种审定委员会审定。该品种遗传性状稳定,田间长势较强,易烘烤;抗黑胫病,中抗青枯病和根结线虫病;经济性状、外观质量、物理性状优于对照K326;感官质量与对照K326相当;并具有烤后烟叶钾含量高(中部烟叶比云烟87高29.95%)、含梗率低(中部烟叶比云烟87低10.55%)的显著优点。贵烟5号适宜在西南、华中烟区种植,是一个工业利用价值和农业生产效益兼顾的优良新品种。     

晒烟品种塘蓬烟抗白粉病基因的等位性测定和序列分析

  背景和目的  广东连江县晒烟品种"塘蓬烟"是我国特有的烟草隐性遗传白粉病抗性种质资源,但到目前为止对其抗病机制未见深入报道。  方法  利用塘蓬烟花粉与抗白粉病烟草品种Kutsaga E1及感病品种K326杂交进行抗病基因的等位性检测;利用等位基因分子标记检测塘蓬烟中感白粉病基因NtMLO1/2的突变情况;利用PCR克隆技术获得塘蓬烟NtMLO1/2基因的cDNA和gDNA序列信息,明确基因突变类型。  结果  （1）根据等位性测验结果推断塘蓬烟白粉病抗性由NtMLO1/2隐性突变基因控制。（2）等位基因分子标记检测和PCR克隆测序结果发现塘蓬烟NtMLO2基因的转录本发生外显子重复突变,形成一个新的可变剪接变异体。  结论  本研究从分子水平阐述了地方烟草品种塘蓬烟的抗白粉病机制,其结果不仅丰富了烟草抗白粉病基因资源信息,而且为日后抗性基因资源的深入研究和合理利用提供了参考依据。      

烟草半胱氨酸蛋白酶抑制剂（CPI）基因家族的克隆及组织表达谱分析

运用生物信息学方法,结合RT-PCR和SMART RACE技术从烟草（Nicotiana tabacum）中克隆了4个CPI基因的全长cDNA序列,分别命名为NtCPI1、NtCPI2、NtCPI3和NtCPI4, GenBank登陆号分别为KF057988、KF057989、KF057990和KF057991。基因序列分析表明4个基因分别编码98、98、120和123个氨基酸残基的蛋白质,都具有CPI反应位点的保守基序GG、QXVXQ和A/PW,同时具有植物CPI所特有的LARFAV基序,其中NtCPI3和NtCPI4的N端还包含一段27个氨基酸残基组成的信号肽。实时荧光定量PCR试验表明,4个基因的组织表达谱很广,在根、茎、叶和芽组织中都有表达。这些结果为进一步研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂在植物中的生理功能奠定了基础。      

一个受青枯病菌诱导的烟草功能基因NtCNGC1的克隆与表达分析

前期转录组研究发现1个环核苷酸门控离子通道（CNGC）基因在抗青枯病烟草品种DB101中上调表达,推测可能参与抵抗烟草青枯病菌侵染的防卫反应。为进一步研究该基因在烟草诱导防御反应中的作用,本研究采用PCR扩增法从DB101中获得烟草CNGC基因的cDNA和基因组序列,命名为NtCNGC1基因。生物信息学和基因表达分析表明,该基因含有8个外显子和7个内含子,编码区（CDS）全长2154 bp,编码717个氨基酸,蛋白分子量为83 kD,理论等电点为9.35。在NtCNGC1基因起始密码子上游1500 bp的核苷酸序列区间预测到防御与应激反应、病原菌应答、水杨酸响应、真菌激发子响应及伤口响应等应答元件。NtCNGC1基因在烟草根中表达最高、茎中其次、叶中最低。受青枯病菌诱导后,NtCNGC1基因在抗病品种（DB101）中的表达量明显高于感病品种（红花大金元）。初步证实NtCNGC1为烟草青枯病抗性相关基因。