人源抗-HBs Fab与IFN-α融合蛋白的克隆与原核表达

目的:构建人源单克隆抗-HBs Fab-IFN-α表达载体,探讨该融合蛋白原核表达的可行性及其生物学活性.方法:用PCR体外扩增目的基因IFN-α,单酶点插入已含人源抗-HBsFab基因的载体,插入点位于轻链基因3‘未端,利用酶切、PCR鉴定筛选正确插入的阳性克隆,转化大肠杆菌,挑选单克隆表达、纯化目的蛋白,用ELISA方法检测融合蛋白IFN-α的抗原性及其抗体亲和性,用WISH细胞检测IFN-α生物学活性.结果:利用插入了人源抗-HBs Fab基因及IFN-α基因的pBAD/gⅢA原核表达系统,成功表达了具生物活性的λ轻链与IFN-α的融合蛋白,其既具有与抗-HBs Fab相近的HBsAg的亲和力,又具有干扰素的活性.结论:λ轻链与IFN-α融合蛋白的成功表达表明,应用原核系统能够同时表达某些特异抗体和其介导的部分生物活性因子,是一种经济、有效的方法,为特异抗体及其介导融合蛋白的制备和临床应用提供了线索.     

中国天疱疮患者的免疫遗传易感性研究

目的探讨中国天疱疮患者的免疫易感基因位点.方法本实验应用序列特异性引物聚合酶链式反应(SSP-PCR)技术对HLA-II类等位基因进行特异性体外扩增,分析了天疱疮患者HLA基因的DR位点和DRB1、DQB1多态性,并将天疱疮患者的基因频率与正常人结果进行χ2检验,以探讨中国天疱疮易感性基因位点.结果天疱疮患者中DR4的频率为93.3%(28/30),DR14的频率为63.3%(19/30),天疱疮患者中的DRB1*04和DRB1*14的频率分别为40%(12/30)和53.3%(16/30),经χ2分析,与正常对照组相比具有显著的差异性;在28个DR4+的天疱疮患者中有13个DRB1*0402,在19个DR14+天疱疮患者中DRB1*1401频率显著增高(P<0.01).所有DRB1*04+患者均为DQB1*0302,所有DRB1*14患者均为DQB1*0503.结论中国人天疱疮易感性与HLA的DR4、DR14抗原以及DRB1*04、DRB1*14、DRB1*0402、DRB1*1401基因位点与高度相关.     

自身免疫性肝病患者自身抗体的分析

目的了解自身免疫性肝病患者可能出现的各种自身抗体阳性率.方法分别应用间接免疫荧光法和免疫印迹法检测200例健康人和178例自身免疫性肝病患者(分为自身免疫性肝炎组、原发性胆汁性肝硬化组及未明原因肝损组)血清中多种自身抗体,分析各组自身抗体出现的阳性率.结果自身免疫性肝炎组可按所出现的自身抗体的类型的不同分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型,各型所占比例分别为75%、8.3%、16.7%.原发性胆汁性肝硬化组抗线粒体抗体(AMA)100%阳性,其中M2型AMA的阳性率高达95.5%.未明原因肝损患者自身抗体的出现率达80.0%,有20%未出现自身抗体,4.5%患者出现未知自身抗体.结论大多数自身免疫性肝病伴有特征性自身抗体的出现;注重自身抗体的检测对于明确诊断自身免疫性肝病和分类有重要的临床意义.     

人源抗-HBs轻链与干扰素-α融合蛋白的克隆及表达

目的构建人源单克隆抗-HBs Fab片段-IFNα表达载体，对原核表达该融合蛋白的可行性及其效果进行实验研究。方法用聚合酶链反应（PCR）体外扩增目的基因IFN—α，单酶点插入已含人源抗HBs Fab基因的载体，插入点位于轻链基因3’末端，利用酶切、PCR鉴定，测序筛选正确插入的阳性克隆，转化大肠埃希菌Top10．挑选单克隆表达、纯化目的蛋白，用酶联免疫吸附法（ELISA）检测融合蛋白的抗原性，用Dotblot和WISH细胞检测其生物学活性。结果利用插入了人源抗-HBs Fab段基因及IFN-α基因的pBAD／gⅢA原核表达系统，成功表达了具生物活性的轻链与IFN-α的融合蛋白，其与HBsAg的亲合力与抗-HBs—Fab相近，而且具有干扰素的活性。融合蛋白对HepG2．2．15细胞初步实验结果亦显示出其具有良好的靶向性及致凋亡作用。结论轻链与干扰素IFN—α融合蛋白的成功表达表明，应用原核系统能够同时表达特异抗体和其介导的某些生物活性因子，不失为一种经济、有效的方法，为特异抗体及其介导融合蛋白的制备和临床应用提供了实验依据。     

PBAD表达系统对抗-HBs Fab抗体表达的影响

目的研究PBADP替换Plac的原核表达系统对重组抗-HBs Fabs的表达效率、产量及其抗体活性的影响。方法通过Western blot、抗体不同稀释度的Dot blot和抗原特异性结合实验，对两种表达系统进行比较。结果在PBAD控制下表达的抗．HBs Fabs与Plac控制下的相比，Western blot显示两种表达系统都能完整表达抗-HBs Fab抗体，Mr为50000。PBAD表达系统表达的抗-HBs Fabs多以可溶形式存在于周质腔中，而Plac表达系统表达的抗-HBs Fabs更多的释放入培养上清液。抗体不同稀释度的Dot blot结果显示pBAD-抗HBs Fab表达系统表达的抗体效价较pComb3-抗HBs Fad高，乙型肝炎表面抗原特异性结合实验证实两种表达系统表达的抗体的抗原结合活性无明显差别。结论PBAD表达系统明显提高了抗-HBs Fab的表达量并保持了原抗体活性。     

慢性肝炎与肝癌患者血清中肝特异性自身抗体的差异分析

目的　阐明慢性肝炎与肝癌患者血清中肝特异性自身抗体的差异。方法　以肝组织切片和可溶性肝抗原为抗原基质 ,用间接免疫荧光法和蛋白印迹检测 40 0例慢性肝炎、肝硬化和 12 1例原发性肝癌患者血清中的肝特异性自身抗体。结果　免疫荧光法显示肝癌患者血清中肝特异性自身抗体的阳性率 (2 9.7% )显著高于慢性肝炎 (18.75 % )。蛋白印迹法测得两组病例自身抗体的阳性率相近 ,且靶抗原相对分子质量多分布在2 0× 10 3 ～ 5 5× 10 3 之间 ,有 19.83%肝癌和 1.75 %的慢性肝病患者的血清在 2 0× 10 3 左右处有 1～ 2条明显的阳性带。结论　慢性肝病和肝癌患者体内不仅存在相似的自身免疫紊乱 ,且随着病情的变化部分肝癌患者体内的自身靶抗原发生了改变。进一步纯化、鉴定这些有意义的靶抗原分子将有助于探讨自身免疫在慢性肝病的转归和恶性变中的作用。     

一种新的胰腺癌相关性自身抗原PAA47的纯化和鉴定

以往的研究发现 6 3 6 4 %的胰腺癌患者具有针对相对分子质量初步鉴定为 4 70 0 0的靶抗原的阳性共带 ,该条带仅在1 9%的正常人中查及 ,本研究旨在纯化并鉴定该靶抗原 ,以深入认识该独特的自身免疫现象在胰腺癌中的意义 ,探索靶抗原的生物学功能以及在临床诊断中可能应用价值。提取人喉癌上皮细胞 (Hep 2 )蛋白抗原 ,进行双向电泳 ,选取 8份以往在单向蛋白质印迹 (SDS PAGE )中 ,相对分子质量约为 4 70 0 0处有明显抗原抗体反应的胰腺癌患者血清进行免疫印迹分析。比较双向电泳凝胶图像、丽春红染色之蛋白质转印硝酸纤维素滤膜图像以及血清反应后滤膜图像 ,确定靶抗原在凝胶上的斑点 ,判断其等电点。切取胶上蛋白质斑点经胰蛋白酶消化后通过HPLC MS联用分析获得串级质谱数据 ;利用互联网搜索工具MASCOT分析处理数据并进行数据库查询 ,以鉴定靶抗原。结果表明 ,KIAA0 111的基因预测产物是一种新鉴定的胰腺癌相关性自身抗体靶抗原 ,有希望成为新的胰腺癌标志物     

新的肝脏特异性自身抗原的筛选、克隆、表达的研究

自身抗体特别是肝脏特异性目身抗体是目身免疫性肝病的主要特点，也是自身免疫性肝病的诊断和分型的主要标志。我们在2例高度怀疑自身免疫性肝病的患者血清中检测到一新的不明肝特异性自身抗体，应用表达性噬菌体文库筛选技术对未知自身抗原进行筛选鉴定，以期建立更为完善的自身抗体检测体系，进一步明确自身抗原在自身免疫性肝病发病机制中所起的作用。