2000年2月份全国疾病监测点35种法定传染病疫情动态分析

本研究通过对我国部分地区的自然人群和非甲非戊型肝炎病人进行HGV和TTV感染的分子流行病学研究,探讨这两种病毒在我国肝炎发病尤其是在非甲非戊型肝炎中的作用和地位.用建立的PCR方法检测血清标本中的HGV RNA和TTV DNA,对调查的自然人群和非甲非戊型肝炎病人血清标本进行检测.HGV RNA采用反转录PCR(RT-PCR)检测,TTV DNA则采用巢式PCR方法检测.结果表明,HGV在自然人群中HGV RNA携带率为0.6%～1.1%,TTV的病原携带率则高达7.1%～12.4%;非甲非戊型肝炎病人中HGV和TTV的阳性率分别为7.9%和28.1%.在所检测的非甲非戊肝炎病人中HGV和TTV的总感染率为35.9%(包括了HGV和TTV的混合感染).因此,HGV在自然人群中感染率低,而且在非甲非戊型肝炎病人中约为10%的病人是由HGV的感染所致,HGV不是非甲非戊型肝炎病人的主要病因.TTV DNA在自然人群中的携带率约为10%,类似于HBV DNA的携带率.虽然在非甲非戊型肝炎病人中TTV DNA的阳性率为28%,但仍然有高达60%的病人病因不明,TTV感染也不是非甲非戊型肝炎病人的主要致病病原.     

中国部分地区新型肝炎病毒TTV感染的分子流行病学

目的了解我国部分地区新型肝炎病毒ＴＴＶ感染的分子流行病学、ＴＴＶ在人群中的感染分布状况,探讨ＴＴＶ在肝炎发病中的作用和地位。方法采用ＰＣＲ方法检测血清标本中ＴＴＶＤＮＡ,克隆测定不同地理株ＴＴＶ的部分基因序列,分析其基因变异情况。结果检测了南方（广东深圳和江苏南京）和北方（北京和辽宁沈阳）的１１２例非甲～非庚型肝炎病人,其中ＴＴＶＤＮＡ阳性者４８例,阳性率４２．９％,而１０２例甲～庚型肝炎病人中阳性率为２．９％（χ２＝４２．８,Ｐ＜０．０１）。ＡＬＴ异常而无甲～庚型肝炎病毒感染标志的献血员中,ＴＴＶＤＮＡ阳性率（３４６％）明显高于ＡＬＴ正常献血员的阳性率（１６．８％,χ２＝４．５,Ｐ＜０．０１）。南方株（广东深圳ＴＴＶＣＨＮ００２、南京ＴＴＶＮＡＮ００１）和北方株（北京ＴＴＶＳＨＢ０１５）病毒间同源性在９８％以上,日本发表的序列同源性也高于９７％。结论我国北方和南方地区均存在ＴＴＶ感染。ＴＴＶ感染与ＡＬＴ异常有极为密切的关系,可能是导致非甲～非庚型肝炎的重要病原。正常人群中存在ＴＴＶ感染者,类似于ＨＢｓＡｇ的所谓“慢性携带状态”。     

轮状病毒组特异性抗原VP6在重组腺病毒中的表达及其免疫学效果的研究

目的 构建可表达A组轮状病毒组特异性抗原VP6的非复制型重组腺病毒载体，并对其生物学和免疫学性质进行研究。方法 将人轮状病毒VP6基因插入腺病毒载体pShuttle-CMV中，通过细胞内同源重组方法获得重组腺病毒DNA，将其转染293细胞获得重组腺病毒。用聚合酶链反应（PCR）及Southern blot方法，检测目的基因在重组腺病毒中的整合，用Western blot检测VP6的表达。通过灌胃和滴鼻两种途径对小鼠进行免疫，并对免疫后小鼠体液和粘膜免疫进行分析。结果 得到了重组腺病毒rvAd-VP6,VP6基因整合于腺病毒基因且中，在293细胞中可稳定表达。2次免疫后灌胃和滴鼻两组小鼠均产生明显免疫应答，血清IgG抗体滴度分别为1：1000和1：10000－1：100000。除了血清IgG外，小鼠还产生了较强的针对轮状病毒的血清IgA，滴度为1：10－1：100。滴鼻组在肺灌洗液和肠匀浆液中均可检测到分泌型IgA(sIgA)，灌胃组仅在肠道检测到sIgA。滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组。结论 人轮状病毒VP6基因重组腺病毒载体的成功构建及所取得的良好免疫学效果，为我国具有自主知识产权的新型轮状病毒基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

鉴别病毒受体方法的研究进展

病毒与易感细胞上的受体分子相结合 ,是病毒进入细胞的第一步 ,也是病毒嗜性的基础。这些受体分子介导的病理过程很可能与病毒的致病机制相关 ,鉴别病毒的受体对于了解其组织嗜性和病理机制 ,制定预防和治疗措施有着重要的意义。而且也为了解病毒与细胞的相互作用 ,病毒的感染周期等有趣的问题提供了最基础的切入点。本文谨就识别病毒蛋白受体的几种方法的研究进展综述如下。1　筛选易感细胞的ｃＤＮＡ文库鉴别受体蛋白这是一种既经典又在不断发展的方法。易感细胞的易感性来源于细胞内编码受体蛋白基因的表达 ,建立所有表达基因的ｃＤＮＡ…     

检测β3-整合素基因在汉坦病毒敏感细胞中的表达

目的 克隆表达β3-整合素基因，制备抗体，并用之进行β3-整合素表达阴性Vero细胞的分离和富集，方法 采用RT-PCR扩增克隆β3-整合素基因，亚克隆至pQE30表达质粒，在原核细胞中表达，免疫印迹实验确证其表达及免疫反应性，纯化蛋白免疫接种家兔制备抗体，补体倡导 的抗体依赖性的细胞毒实验分离富集目的细胞，免疫荧光及免疫印迹检测筛选结果，结果成功克隆β3-整合素基因，并在pQE30表达系统中得到高效表达，免疫印迹证实所表达的β3-整合素蛋白具有良好的免疫反应性，制备了高效抗体，免疫荧光及免疫印迹均未检测出β3-整合素在Vero,VeroE6,Hep-2,2BS和293等汉坦病毒敏感细胞表面的表达。结论 除β3-整合素外，汉坦病毒很可能还有别的受体。     

套式PCR和原位杂交技术检测肝病患者单个核细胞内TTV DNA

目的　了解慢性乙型肝炎(中度)和原发性肝癌(HBsAg阳性)患者PBMC内TTVDNA存在情况。方法　采用套式PCR以及原位杂交技术检测外周血单个核细胞(PBMC)内TTVDNA。结果　套式PCR检测26例慢性乙型肝炎(中度)患者PBMC内TTVDNA阳性7例,阳性率269%,非常显著高于健康对照(χ2=143,P<0.001);21例原发性肝癌(HBsAg阳性)患者PBMC内TTVDNA阳性4例,阳性率190%,显著高于健康对照(χ2=486,P<0.05)。7例PBMC内TTVDNA阳性的慢性乙型肝炎(中度)患者PBMC原位杂交,其中4例细胞内阳性。结论　慢性乙型肝炎(中度)和原发性肝癌(HBsAg阳性)患者PBMC细胞浆内存在TTVDNA,且阳性率相当高。     

复制缺陷型重组腺病毒rvAdG1VP7免疫学效果的研究

目的对1株可表达A组轮状病毒主要结构抗原VP7的重组腺病毒rvAdG1VP7的体内免疫学效果进行研究.方法通过灌胃和滴鼻2种途径对BALB/c小鼠进行免疫,并对免疫后小鼠体液和黏膜免疫进行分析.结果初次免疫后,2组小鼠均有应答,但血清IgG抗体滴度及阳转率不同.再次免疫后,显示出明显的加强效果.除了血清IgG外,小鼠还产生了较强的针对轮状病毒的血清IgA.滴鼻组在肺灌洗液和肠匀浆液中均可检测到SIgA,灌胃组仅在肠道检测到SIgA.滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组.对滴鼻组小鼠肺灌洗液IgG/SIgA的阳转率进行了比较,发现IgG的应答水平明显高于SIgA.免疫后小鼠血清中IgG的动态观察表明,抗体可长期持续至少半年以上.结论重组腺病毒载体rvAdG1VP7所取得的良好免疫学效果,为我国具有自主知识产权的新型轮状病毒基因工程疫苗的进一步研制奠定了基础.     

1株表达人轮状病毒VP7的重组腺病毒的生物学特性鉴定

目的对表达轮状病毒VP7基因的1株重组腺病毒rvAdG1VP7(G)的生物学特性进行鉴定,为进一步免疫学研究打下基础.方法用rvAdG1VP7(G)感染293细胞,并分别应用电子显微镜技术以及Southern blot、PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法了解rvAdG1VP7(G)的形态、VP7基因整合、遗传稳定性、VP7基因在细胞内转录及表达等有关生物学特性.结果电子显微镜观察表明:rvAdG1VP7(G)具有典型的腺病毒形态;Southern blot、PCR、RT-PCR和Western blot等分子生物学方法分析显示:rvAdG1VP7(G)中确有特异性的VP7基因稳定整合,有较好的遗传稳定性,感染293细胞后能有效转录,可表达轮状病毒主要结构蛋白VP7.结论 rvAdG1VP7(G)具有良好的生物学性质,为进行体内实验研究提供了必要条件.     

一株TT病毒中国分离株结构区全基因的克隆及序列测定

目的 克隆和序列测定ＴＴ病毒（ＴＴＶ）中国分离株全国基因。方法 采用长片段ＰＣＲ技术从一例临床非甲－非庚型肝炎病人血清中扩增ＴＴＶ全基因,获得３个互相重叠的片段,分别为１９９、３２６９和４３４ｂｐ。用标准分离子生物学方法测定这３个片段的序列,从而得到全长ＴＴＶ基因序列。结果 ＴＴＶ中国分离株全基因长３７３９个核苷酸,含两个开放读码框架。第一个ＯＲＦ位于５８９至２９０１位核苷酸,编码７７０个氨基酸;     

人轮状病毒抗原非复制型重组腺病毒黏膜免疫效果的研究

目的：对人轮状病毒抗原非复制型重组腺病毒诱导黏膜免疫的效果进行初步评价。方法：用表达轮状病毒VP7、VP6基因的3株重组腺病毒rvAdG1VP7(G)、rvAdG1VF7和rvAdVP6，分别通过灌胃和滴鼻两种途径对BALB／C小鼠进行2次免疫后，对肺灌洗液和肺、肠粘膜组织匀浆液中轮状病毒特异性的分泌型IgA(secretory IgA，SIgA)和local-IgG进行检测。结果：对肺灌洗液中特异性SIgA进行检测，发现滴鼻组的免疫学效果明显优于灌胃组。对肺、肠组织匀浆液中特异性IgA的分析表明，灌胃途径刺激异位粘膜组织产生免疫应答的能力较弱。对rvAdVP6滴鼻组小鼠肺灌洗液(1：20)特异性local-IgG和SIgA的阳转率进行比较，发现特异性local-IgG的应答水平明显高于特异性SIgA。结论：重组腺病毒可有效诱导针对轮状病毒的黏膜免疫。此研究为轮状病毒基因工程疫苗的免疫方案、免疫途径及免疫保护作用等的进一步研究莫定了基础。