摩根摩根菌中质粒介导KPC-2型碳青霉烯酶的检测

目的 研究碳青霉烯耐药摩根摩根菌的分子流行病学及其耐药机制.方法 2010年10月-2011年2月从杭州市中医院分离到7株碳青霉烯不敏感的摩根摩根菌.脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株之间的同源性;琼脂稀释法测定抗生素对细菌的最低抑菌浓度(MIC);接合试验、质粒图谱分析、特异性PCR扩增和序列分析等研究细菌对碳青霉烯耐药的分子机制.结果 分离自急诊监护病房的6株摩根摩根菌PFGE条带完全相同或相差1～3个条带;分离自重症监护病房的1株摩根摩根菌与其他6株PFGE条带差异明显.7株摩根摩根菌的耐药模式基本相同.亚胺培南、美罗培南和厄他培南的MIC值差异较大,分别为8μg/ml(耐药)、1μg/ml(敏感)和0.25～0.50μg/ml(敏感或中介耐药).7株摩根摩根菌对青霉素类、氨曲南和环丙沙星耐药,对头孢菌素类耐药或敏感,对阿米卡星敏感.接合试验使大肠埃希菌EC600对碳青霉烯类抗生素由敏感变为耐药,对其他β-内酰胺类抗生素也均耐药.摩根摩根菌及转移接合子均含有一个约为60kb的质粒.PCR扩增及测序表明摩根摩根菌及转移接合子均产KPC-2型碳青霉烯酶,且携带qnrS1基因.结论 首次在摩根摩根菌中检测到KPC-2型碳青霉烯酶,KPC-2是引起摩根摩根菌对碳青霉烯类不敏感的主要原因.     

基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱仪快速鉴别甲氧西林耐药和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌的研究

目的：分析基质辅助激光解吸／电离飞行时间质谱仪（ matrix-assisted laser desorption／ionization time-of-flight mass spectrometry , MALDI-TOF MS）快速鉴别甲氧西林耐药和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌。方法收集浙江大学医学院附属第二医院已保存的临床分离的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）25株和甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）30株用于模型的建立。同时选取34株临床分离株（12株MRSA和22株MSSA）用做模型验证菌株。 MALDI-TOF MS对所有菌株进行鉴定,ClinProTools 3．0软件对MALDI-TOF MS鉴定细菌所产生的质谱峰图进行分析。结果 ClinPro-Tools软件的4种算法所得出的结果基本一致,灵敏度均大于95．0％,其中遗传算法（GA）的灵敏度最高（100．0％）;除监督式神经网络算法（ SNN）外,其余3种算法的特异性均大于90．0％。质荷比为3279、6485、6555和3299 m／z的质谱峰是用于区分MRSA和MSSA的最为主要的特征性峰。受试者工作特征曲线（ ROC）显示,这4个特征性峰的曲线下面积（ AUC）均大于0．9;凝胶浏览图显示,MSSA组的3279、6485、6555 m／z峰的蛋白强度高于MRSA组,而3299 m／z峰的蛋白强度低于MRSA组。外部验证显示,GA模型对MRSA组的准确鉴定率为83．3％,对MSSA组的准确鉴定率为90．9％。结论在严格控制实验条件的情况下,MALDI-TOF MS可快速准确地鉴别MRSA和MSSA,具有耗时短,灵敏性高,特异性高的优点。准确鉴定的同时区分MRSA和MSSA,尽早为临床防治MRSA提供参考依据,限制其传播及暴发流行。     

耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌对利奈唑胺的耐药机制及分子流行病学研究

目的 研究耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌(MRCoNS)临床分离株对利奈唑胺的耐药机制及分子流行病学.方法 2011年3-8月我院分离到17株对利奈唑胺耐药的MRCoNS,包括10株头状葡萄球菌、4株科氏葡萄球菌、2株溶血葡萄球菌和1株松鼠葡萄球菌.用E-test法测定抗生素对细菌的最低抑菌浓度(MIC);脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株之间的同源性;PCR扩增和序列分析研究细菌对利奈唑胺耐药的分子机制.结果 9株利奈唑胺MIC值为＞256 μg/ml的头状葡萄球菌为同一克隆株,MIC值为4μg/ml的另1株头状葡萄球菌为密切相关菌株.4株利奈唑胺MIC值为＞256 μg/ml的科氏葡萄球菌为同一克隆株.松鼠葡萄球菌利奈唑胺MIC值为64 μg/ml,2株溶血葡萄球菌分别为4 μg/ml和6μ/ml.对23S rRNA基因第5功能区和cfr基因进行PCR扩增和测序发现,9株利奈唑胺MIC值为＞256 μg/ml的头状葡萄球菌的23S rRNA基因第5功能区存在常见G2576T突变和一个未报道过的C2104T突变;松鼠葡萄球菌存在G2576T突变;除松鼠葡萄球菌外,其余16株菌株均携带cfr基因.结论 首次报道在国内分离到利奈唑胺耐药的葡萄球菌临床菌株.MRCoNS对利奈唑胺耐药与23S rRNA基因第5功能区碱基突变和携带cfr基因相关.利奈唑胺耐药MRCoNS在我院有克隆传播现象.     

改良Hodge试验检测肠杆菌科细菌中碳青霉烯酶的研究

目的 用改良Hodge试验(MHT)检测肠杆菌科细菌碳青霉烯酶的产生,了解碳青霉烯酶基因分布.方法 从浙江大学医学院附属第二医院、浙江省东阳市人民医院、北京医院和四川大学附属华西医院4家医院收集3 718株肠杆菌科细菌,用纸片法检测细菌对厄他培南的敏感性,用MHT检测碳青霉烯酶的产生情况,并用PCR扩增常见的碳青霉烯酶基因.结果 4家医院的肠杆菌科细菌对厄他培南的不敏感率为3.04％ (113/3718),上述4家医院的不敏感率依次为5.09％、2.15％、2.59％和1.72％.MHT的总阳性率为2.29％ (85/3718),4家医院的阳性率依次为4.73％、1.21％、1.06％和1.58％.113株厄他培南不敏感菌株中,MHT阳性82株,阴性31株.85株MHT阳性菌株中,82株对厄他培南耐药或中介耐药,仅有3株敏感.82株MHT阳性、厄他培南不敏感的菌株中,肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶(KPC)基因阳性65株,亚胺培南水解酶(IMP)基因阳性15株,其中2株KPC和IMP同时阳性,其他4株未扩增到常见碳青霉烯酶基因.31株MHT阴性、厄他培南不敏感的菌株和3株MHT阳性、厄他培南敏感的菌株均未扩增到常见碳青霉烯酶基因.结论 MHT可有效地检测肠杆菌科细菌中的碳青霉烯酶,具有敏感性高、假阳性率低的特点.肠杆菌科细菌所产碳青霉烯酶主要为KPC,其次为IMP.     

β-内酰胺酶合并OmpK36膜孔蛋白缺失引起肺炎克雷伯菌对碳青霉烯类抗生素敏感性的降低

目的 研究肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae,Kp)对碳青霉烯类抗生素敏感性降低的分子机制.方法 临床分离到2株碳青霉烯敏感性降低的Kp Z2554和Z2110,经脉冲场凝胶电泳(PFGE)证实非同一克隆株.对2株细菌进行药物最低抑菌浓度测定(MIC)、接合试验、质粒图谱分析、等电聚焦电泳(IEF)、特异性PCR扩增和DNA序列分析、外膜蛋白分析以及羰酰氰氯苯腙(CCCP)抑制试验等.结果 Kp Z2554和Z2110对亚胺培南和美罗培南的MIC为1～8 μg/ml,前者对青霉素类、头孢菌素类和氨曲南等抗生素高度耐药,后者对上述抗生素的耐药程度稍弱于前者,但对头孢西丁的MIC大于512 μg/ml.IEF、PCR扩增和DNA序列分析证实Kp Z2554产TEM-1(等电点5.4)和CTX-M-14(等电点7.9)2种β-内酰胺酶,Kp Z2110产TEM-1、CTX-M-14和DHA-1(等电点7.8)3种酶.SDS-PAGE分析显示2株细菌均有相对分子质量(Mr)为39×103蛋白条带(OmpK36)的缺失.外膜蛋白基因(ompK35和ompK36)序列分析发现,Kp Z2554和Z2110的ompK35基因的个别位点存在点突变,但氨基酸序列不变.CCCP抑制试验显示CCCP不能提高Kp Z2554和Z2110对碳青霉烯类抗生素的敏感性.结论 β-内酰胺酶的产生合并OmpK36膜孔蛋白的缺失可引起Kp对碳青霉烯类抗生素敏感性的降低.     

MALDI-TOF MS在临床常见菌快速鉴定中的应用研究

目的 评价MALDI-TOF MS在临床常见细菌快速鉴定中的应用.方法 选择浙江大学医学院附属第二医院2008年12月至2009年8月分离自血液、痰液、分泌物和尿液的临床常见细菌和浙江省疾病预防与控制中心收集的沙门菌共426株.包括革兰阳性球菌76株和革兰阴性杆菌350株.采用Vitek系统将细菌鉴定到种,血清凝集试验对沙门菌和志贺菌进行血清分型.PCR扩增91株细菌的16S rDNA基因并测序,所得核苷酸序列与GenBank中的数据库进行比对,确定细菌种类.用MALDI-TOF MS对所有细菌进行快速鉴定,比较不同鉴定方法 之间的符合情况.结果 除沙门菌和志贺菌外的所有革兰阳性球菌和革兰阴性杆菌的Vitek和MALDI-TOF MS两者的鉴定结果 完全符合.23株沙门菌中只有2株肠炎沙门菌鼠伤寒血清型的3种鉴定方法 结果 相符,另有1株伤寒沙门菌、3株甲型副伤寒沙门菌、1株乙型副伤寒沙门菌、1株肠炎沙门菌和1株肠炎沙门菌病牛血清型的血清凝集结果 与16s rDNA基因测序结果 相符.Vitek及血清凝集试验鉴定为福氏志贺菌的4株菌16s rDNA基因测序和MALDI-TOF MS的鉴定结果 均为大肠埃希菌.结论 MALDI-TOF MS可快速、准确地对细菌进行鉴定,具有良好的重复性,但对沙门菌和志贺菌效果不佳.     

碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌感染39例

目的 探讨碳青霉烯类耐药肺炎克雷伯菌(carbapenem-resistant Klebsiella pneumoniae,CRKP)感染的临床特点、易感因素及防治措施.方法 对2006年7月至2008年7月在浙江大学医学院附属第二医院不同病区住院期间分离和培养到CRKP且临床证实为医院感染的39例患者进行回顾性调查分析.结果 39份CRKP阳性标本中,痰标本22份,占56.4%,CRKP感染者平均年龄为64.0岁,平均住院时间达80.8 d,36例2周内曾入住ICU,其中以脑科ICU比例最高,意识障碍者26例,38例留置导尿,34例留置中心静脉导管,32例行机械通气,30例行气管插管,27例(69.2%)合并其他细菌感染,8例合并真菌感染.病情恶化及死亡18例,占46.2%.在培养到CRKP前,27例(69.2%)患者更换超过4种抗菌药物,使用最多的为β-内酰胺酶抑制剂合剂和碳青霉烯类抗菌药物.结论 CRKP感染多发生在老年及长时间住院的患者中,以ICU患者居多,各种侵入性操作可增加其感染概率.     

对亚胺培南耐药粘质沙雷菌中质粒介导KPC-2型碳青霉烯酶的研究分析

目的研究粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的分子机制。方法临床分离到1株亚胺培南耐药的粘质沙雷菌[最小抑菌浓度（MIC）为64μg／m1]。将粘质沙雷菌和大肠杆菌进行接合试验，采用琼脂稀释法检测粘质沙雷菌和接合前后大肠杆菌对药物的MIC；提取粘质沙雷菌和接合后大肠杆菌的酶粗提液进行等电聚焦电泳和三维试验；特异性PCR扩增和DNA序列分析确认引起粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的β-内酰胺酶的基因型。结果除碳青霉烯类抗生素外，粘质沙雷菌还对青霉素类、头孢菌素类和单酰胺类等抗生素耐药，对喹诺酮类和氨基糖甙类抗生素敏感；接合试验可使大肠杆菌获得与粘质沙雷菌相似的耐药谱；等电聚焦电泳显示粘质沙雷菌中存在等电点（P1）分别为6．5和6．7的两种β内酰胺酶，接合后的大肠杆菌存在PI为6．7的β-内酰胺酶；特异性PCR扩增和DNA序列分析证实PI为6．7的β-内酰胺酶为碳青霉烯酶KPC-2，其核苷酸及氨基酸序列已递交到GenBank，PI为6．5的酶有待进一步研究；在三维试验中，克拉维酸、乙二胺四乙酸（EDTA）和氯唑西林均不能抑制KPG2酶对亚胺培南的水解活性。结论首次在粘质沙雷菌中发现碳青霉烯酶KPG2，该酶是引起粘质沙雷菌对亚胺培南耐药的主要原因。     

MALDI-TOF MS在细菌耐药性检测中的应用

质谱是测量离子质荷比的一种分析技术,其基本原理是样品中各组分在离子源中发生电离,产生不同荷质比的带正电荷的离子,阳离子经电场加速形成离子束,进入质量分析器,阳离子在电场和磁场的作用下发生偏转而被分开形成质谱图,从而确定离子的质量.质谱仪种类非常多,工作原理和应用范围也有很大的不同.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)是20世纪80年代发展起来的一种快速分析大分子的方法,现已广泛应用于生命科学及相关领域,是检测和鉴定蛋白质、多肽、多糖、核酸等生物分子的有力工具.早在1975年质谱技术就被尝试用于微生物鉴定,但是由于当时技术条件的限制以及细菌的生长条件和培养基对质谱结果的影响非常大,导致实验结果很难重复[1].MALDI-TOF MS的出现和迅速发展使较大分子质量的生物分子分析成为可能[2-3],并被成功应用于细菌鉴定[4-8].近几年由于质谱技术的不断改进和数据库的不断完善,微生物实验室已经能够应用MALDI-TOF MS快速、准确、低成本地对细菌和真菌进行鉴定[9-10].     

1株产GES-1型碳青霉烯酶铜绿假单胞菌的全基因组测序分析

目的了解产GES-1型碳青霉烯酶铜绿假单胞菌的分子流行特征。方法采用Illumina HiSeq X10测序平台对1株产GES-1型碳青霉烯酶铜绿假单胞菌进行全基因组测序,通过Kleborate和ResFinder分析菌株的多位点序例分型(MLST)、毒力基因和抗菌药物耐药基因,并分析bla_(GES-1)基因的周围环境。结果经比对,本菌为ST235型,血清分型为O11型,共携带12个抗菌药物耐药基因,分别为aac(6′)-Ⅰb3、aadA10、aph(3′)-Ⅱb、aph(3′)-XV、bla_(GES-1)、bla_(OXA-50)、bla_(PAO)、crpP、sul1、tet(G)、fosA、catB7;bla_(GES-1)位于含有3 150 bp的NODE_219片段中,该片段与GenBank中的KY860573菌株的72068—75217序列99.94%一致。其基因环境为位于上游的整合子1(intl1),β-内酰胺类耐药基因bla_(GES-1),氨基糖苷类/氟喹诺酮类耐药基因aac(6′)-Ⅰb3,氨基糖苷类耐药基因aph(3′)-XV及位于下游的插入序列ISPa21e。该菌包含有357个毒力基因,为exoU~+/exoS~-基因型。结论本菌为全球流行的高风险克隆ST235,exoU~+/exoS~-基因型。全基因组测序分析提供了bla_(GES-1)基因环境、基因分型、耐药基因、毒力基因等多种信息。