hTERT干扰真核表达载体的构建及鉴定

目的构建和鉴定人端粒酶逆转录酶(hTERT)干扰真核表达载体.方法人工合成hTERT干扰序列并定向克隆到siRNA(small interfereace RNA)真核表达载体pSilencer 3.1-H1 neo;采用PCR、酶切和测序鉴定.结果成功构建了hTERT干扰真核表达载体.结论hTERT干扰真核表达载体的构建为进一步研究端粒、端粒酶在肿瘤细胞中的生物学作用奠定了基础.     

胃癌错配修复基因hMLH1突变和启动子甲基化与基因不稳的关系

目的　探讨胃癌hMLH1突变和甲基化异常与微卫星不稳 (MSI)的关系。方法　采用二维DNA电泳和DNA测序技术检测hMLH1突变 ;采用甲基化特异性PCR检测hMLH1启动子区的甲基化状态 ;采用PCR为基础的方法检测微卫星DNA不稳。结果　 6 8例胃癌中检出hMLH1基因突变 3例 ,突变率为 4 .4 %。hMLH1突变与肿瘤大小、分化程度、组织学类型、浸润深度和临床病理分期无显著相关。正常胃黏膜未见hMLH1高甲基化。 6 8例胃癌中检出hMLH1高甲基化 11例 ,占 16 .2 % ,均为去甲基化和高甲基化并存。将MSI分为高频率MSI(MSI H ,≥ 2个位点 ) 8例、低频率MSI(MSI L ,仅为 1个位点 ) 9例和MSI阴性 (MSS) 5 1例三组 ,结果 3例hMLH1基因突变均发生于MSI H组 ,而MSI L和MSS组未见有突变者。MSI H组hMLH1高甲基化的检出率显著高于MSI L和MSS组 (P <0 .0 1～ 0 .0 0 1)。结论　hMLH1突变和高甲基化可能参与了MSI病理途径。     

人DNA MTase反义基因转染诱导E-Cadherin基因启动子区域去甲基化

目的：观察人DNA MTase反义基因转染对肝癌细胞系SMMC－7721E－Cadherin基因启动子区域甲基化状态的影响。方法：采用脂质体法将已构建的包含正，反义DNA MTase基因片段的真核表达载体转染入肝癌细胞系SMMC－7721；用甲基化特异的PCR法检测E－Cadherin基因启动子区域甲基化状态的改变，结果：PCR法扩增外源性NeoR基因证实用脂体法成功将重组载体转染入细胞，甲基化特异的PCR法检测显示转染反义DNA MTase基因片段的SMMC－7721细胞中的E－Cadherin基因启动子区域呈现去甲基化状态。结论：人DNA MTase反义基因片段可诱导E－Cadherin基因启动子区域去甲基化，实验结果有助于进一步了解DNA MTase在肝癌发展中的作用。     

人胃神经细胞体外培养

体外培养冲经细胞是研究神经电生理、药理、再生及移植等的重要手段．对相关领域科研发展起了重要促进作用．但目前体外培养神经细胞来源几乎全集中于脑、脊髓神经系统．取材种属电多为鼠类或鸡胚．来源于其他种属组织的鲜有报道。胃神经系统在胃肠动力性疾病的发病机制中起重要作用，因此，我们采用人胎胃和成人手术切除标本为细胞来源．进行人胃神经元原代培养研究，以期为进一步研究胃神经生理特性、疾病和药理机制等提供实验基础。     

人胃癌细胞SGC7901端粒酶的亲和纯化

尽管已意识到端粒酶可能是目前已知特异性最好的肿瘤标志，但端粒酶的临床应用迄今未能得以普及推广，其原因之一是人端粒酶的蛋白组份仍不十分清楚。为此，我们利用端粒酶核糖核蛋白的特性，尝试建立一种亲和纯化人端粒酶的手段，以期获得具有完整活性的亲和纯人胃癌端粒酶并推动端粒酶结构及应用性研究的深入。     

自由基在实验性胃癌及癌前病变发生中的作用

目的探讨自由基在胃癌及其癌前病变发生中的作用．方法将１００只Ｗｉｓｔａｒ大鼠分为２组，实验组（７０只），给予１００ｍｇ／Ｌ甲基硝基亚硝基胍（ＭＮＮＧ）水溶液自由饮用３０ｗｋ，对照组（３０只）饮用自来水．选５个时相点，动态观察ＭＮＮＧ诱发实验性胃癌及其癌前病变过程中大鼠体内丙二醛（ＭＤＡ）、脂质过氧化物（ＬＰＯ）、谷胱甘肽过氧化物酶（ＧＳＨＰＸ）及超氧化物歧化酶（ＳＯＤ）等的变化情况．结果在实验组，ＭＤＡ平均含量在５２ｗｋ非常显著地大于０ｗｋ（Ｐ＜００１），并显著地大于１６ｗｋ以前（Ｐ＜００５）．胃癌组织ＭＤＡ含量显著高于胃癌癌前病变组织（Ｐ＜００５）．癌组织ＬＰＯ的含量显著高于癌前病变组织（Ｐ＜００５）．实验组，总ＳＯＤ和ＣｕＺｎＳＯＤ活性在５２ｗｋ明显低于１６ｗｋ之前（分别为Ｐ＜００５和Ｐ＜００１）．癌组织ＣｕＺｎＳＯＤ含量非常显著地小于正常胃粘膜（Ｐ＜００１），亦明显低于胃粘膜异型增生和肠上皮化生（Ｐ＜００５）．在３０ｗｋ和５２ｗｋＧＳＨＰＸ活性显著低于１６ｗｋ以前．结论自由基在实验性胃癌及其癌前病变发生中具有一定作用，自由基清除剂可能对胃癌的综合防治具有积极意义     

胃癌组织ras基因群点突变及其一患者预后的关系(英文)

目的研究ｒａｓ基因点突变与胃癌患者预后的关系．方法应用多聚酶链延伸反应—限制性片段长度多态性分析法（ＰＣＲ－ＲＦＬＰ）对８８例福尔马林固定，石蜡包埋胃癌组织ＣＨａｒａｓ第１２位、６１位，Ｋｒａｓ第１２位、１３位和Ｎｒａｓ第１２位密码子的点突变进行检测．结果ｒａｓ基因群总突率为１８２％（１６／８８），点突变的与肿瘤浆膜浸润、淋巴结转移、临床病理分期及术后的生存期密切相关．结论检测胃癌组织ｒａｓ基因群点突变有助于判断胃癌患者的预后．     

hTERT基因修饰对人外周血树突状细胞生物学行为的影响

目的观察人端粒酶逆转录酶（hTERT）基因修饰对树突状细胞生物学行为的影响。方法用负载hTERT目的基因的复制缺陷型腺病毒（rAd—hTERT）感染原代培养的人树突状细胞（DC）以获取hTERT基因修饰的DC（DC—hTERT），采用免疫组化及Westem blot法检测DC-hTERT内hTERT及增殖细胞核抗原（PCNA）的表达；采用流式细胞术检测DC-hTERT表面成熟标志的变化；采用MTT法检测DC-hTERT的增殖能力。结果rAd-hTERT感染DC后hTERT蛋白表达明显增加；流式细胞术检测显示，感染Ad-hTERT后DC表面成熟指标CD83及CD86无明显变化；成熟1312经hTERT修饰后的生长曲线显示，DC-hTERT在前2周数量稍有增加，但DC/PBS及DC/rAd-LacZ数量明显下降，在第3周三者数量均有下降趋势，但DC-hTERT组细胞数量仍明显多于其他两组；Western blot检测显示DC-hTERT内PCNA的表达明显增强。结论hTERT基因表达上调后，DC增殖能力明显增强，衰老速度延缓。     

胃癌细胞株hTERT基因启动子区甲基化分析

目的检测人端粒酶反转录酶(hTERT)基因启动子区甲基化状态。方法采用TRAP法检测细胞端粒酶活性,免疫荧光法观察hTERT表达;选择hTERT启动子中-692～-403bp共290bp为靶序列,采取亚硫酸氢钠修饰和测序法(BSP)检测2种胃癌细胞株中靶序列甲基化状态并作分析。结果端粒酶和hTERT在SGC-7901和BGC-823胃癌细胞株中都有表达;PCR扩增产物测序测出-634～-403bp共232bp,经比对与亚硫酸氢钠转化前源序列对应良好,此序列段26个CpG胞嘧啶中,BGC-823细胞株有25个发生甲基化,SGC-7901细胞株全部发生甲基化,经检索此序列段含2个MZF-2结合域即2个锌指基序,但仅可结合MZF-2一个转录调节因子。结论高甲基化改变了DNA的空间结构可能是hTERT启动子高甲基化上调hTERT表达的原因之一,从而阻断了MZF-2与锌指基序的结合。