膜反向点杂交技术在HIV-1耐药性点突变检测中的应用

目的以HIV基因组pol区序列为靶基因设计可鉴别HIV耐药性突变的寡核甘酸探针对，应用膜反向点杂交技术检测HIV-1耐药性点突变。方法以临床提取HIV-1患者血清为模板，扩增产物与点在尼龙膜上的5对特异的寡核苷酸探针杂交。通过标记在PCR上游引物5’端的荧光素显色得到结果，并将其与测序结果进行对比。结果采用反向点杂交共检测了9例野生型和21例突变耐药型样本，检测结果与测序结果符合率为74％。5对探针对于野生型和突变型的扩增产物均有较好的区分性，敏感性高且信号强弱与相应产物在样本所占比例相关。结论应用膜反向点杂交技术检测HIV耐药性点突变敏感、简便、快速，具有较高应用价值。     

利用消减抑制杂交技术构建MPTP诱导的C57BL小鼠全脑差异表达基因文库

本研究旨在构建1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)诱导的C57BL小鼠全脑差异表达基因文库,并获取差异表达的表达序列标签.通过MPTP腹腔注射建立C57BL小鼠帕金森病模型.利用消减抑制杂交技术建立对照组与实验组差异表达基因文库.自两文库中各随机挑选20个克隆,经反Northern杂交证实其中7个克隆为阳性.同时对上述40个克隆进行序列测定,并与已知序列基因库进行同源性比较,其中26个新基因片段向Genbank申请了序列号.     

新生大鼠小脑内发育相关基因的筛选

为筛选脑发育相关的基因 ,应用新发展的抑制消减杂交技术 ,以新生大鼠小脑mRNA逆转录cDNA作为测试者 (tester) ,成年大鼠小脑mRNA逆转录cDNA作为驱动者 (driver) ,进行消减杂交 ,克隆制备成新生大鼠小脑高表达的cDNA文库。挑选出 5 0个重组质粒 ,测序得到 37个不同基因片段序列。再次用反Northern杂交确认有意义的差异表达基因。同时将测序结果与GenBank注册序列进行同源性比较 ,2 0个大鼠中首次测得的基因表达序列标签 (EST)已被GenBank收录 (BG6 95 72 6 -BG6 95 74 5 )。     

应激和分子伴侣对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞毒性的保护作用

目的:本文探讨应激和分子伴侣(stress and chaperone,STCH)对鱼藤酮的神经毒性之于SH-SY5Y细胞的保护作用及其可能的作用机制。方法:采用不同浓度鱼藤酮处理SH-SY5Y-pcDNA 3.1和SH-SY5Y-pcDNA3.1-STCH稳定细胞株,并观察细胞形态;采用MTT法和Western蛋白印迹法检测MAPK通路相关的信号分子和凋亡相关蛋白变化。结果:与未处理组相比,鱼藤酮均能引起细胞活力显著下降(P<0.05);STCH对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞毒性具有明显的保护作用(0.1μmol/L-5μmol/L),但10μmol/L浓度组与转染空载体组无显著差异。激活型caspase-3蛋白在鱼藤酮毒素处理后表达明显,p38磷酸化增强,过表达STCH在鱼藤酮处理后p38磷酸化受到明显抑制,裂解的caspase-3活性形式减少。结论:STCH对鱼藤酮诱导神经毒性的保护作用可能通过抑制p38磷酸化而实现。     

多环芳烃类物质对细胞色素P450 1A1的诱导表达

目的探讨多环芳香烃类化合物(polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)对细胞色素P450 1A1(CYP 1A1)的诱导表达情况。方法以人肺癌细胞系A549为研究对象,选取16种含量较多的典型的PAHs暴露给药。MTT方法检测不同药物浓度下细胞的存活率以选择合适的给药浓度;在该浓度药物处理24 h后,收集各组细胞的总RNA及蛋白,用实时荧光定量(Real-Time)PCR及Western印迹法检测CYP1A mRNA和蛋白的表达。结果 MTT结果显示,PAHs浓度在0.2 mol/L时,细胞存活率为50%～60%,选用此浓度作为后续实验的给药浓度。与正常对照组相比,fluorene、2,3-benzanthracene、perylene、acenaphthylene和benzo[a]pyrene能显著诱导CYP1A1 mRNA和蛋白的表达(P<0.05)。结论 fluorene、2,3-benzanthracene、perylene、acenaphthylene和benzo[a]pyrene等烟草烟气内存在的化合物对细胞色素酶CYP1A1具有诱导表达作用。     

常染色体显性遗传的良性先天性肌营养不良症

报告一个家系常染色体显性遗传的良性先天性肌营养不良症。先证者的祖父、伯父、父亲、姑母及表妹罹患，完卡符合常染色体显性遗传方式。临床表现酷似Ｂｅｃｋｅｒ型进行性肌营养不良症，呈相对良性经过。肌酸磷酸激酶和乳酸脱氢酶均增高。病肌超微结构主要改变是灶性肌丝溶解和线粒体明显增多，形态各异，但无密集的嵴和类结晶包涵体。     

脑室注射Aβ1—40对大鼠皮质和海马纤连蛋白基因表达的影响

目的：研究脑室注射Aβ1-40对大鼠皮质、海马纤连蛋白基因表达的影响。方法：通过脑室注射Aβ1－40，建立大鼠AD模型，采用逆转录PCR方法研究纤连蛋白在皮质、海马的表达情况。结果：通过Morris氏水迷宫实验、脑片刚果红染色及胆碱乙酰转移酶表达水平等方面验证AD模型成功，在AD鼠皮质、海马纤连蛋白基因高表达。结论：纤连蛋白为整合素的配体，Aβ1-40诱导基基因高表达可能介导Aβ1-40与小胶质细胞的结合，激活小胶质细胞促进神经元死亡。     

人HSP70真核载体的构建及其在胆囊癌细胞中的表达

目的构建真核表达载体pcDNA3．0-Hsp70，并在胆囊癌细胞SGC996中进行表达。方法构建真核表达载体pcDNA3．0-Hsp70，经EcoRⅠ及BarnHⅡ双酶切鉴定并测序；通过脂质体法转染SGC996胆囊癌细胞，经G418抗性筛选获得稳定表达细胞株；用流式细胞术检测其表达情况。结果酶切电泳和DNA测序证实载体构建正确；体外转染入SGC996细胞中后，可见转染细胞有Hsp70蛋白的表达。结论成功构建了pcDNA3．0-Hsp70真核表达载体，为研究Hsp70在肿瘤免治疗中的作用奠定了基础。     

腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP的构建和在神经干细胞中的表达

目的研究腺病毒载体Ad-BDNF-EGFP的构建及其在神经干细胞(NSCs)中的表达。方法通过RT-PCR从大鼠海马中获得BDNF基因,通过基因克隆、HEK293包装,获得含增强绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒表达载体pAd-BDNF-EGFP,将其感染原代培养的神经干细胞,观察EGFP及BDNF2种基因的表达,镜下测定转染率,并检测RT-PCR产物,证实BDNF的存在。转染后的神经干细胞经G418筛选,抗性细胞传代扩增后获得成功转染BDNF基因的NSCs克隆。结果荧光显微镜下可见感染后的NSCs表达EGFP而发出绿色荧光;通过RT-PCR证明感染后的NSCs具有表达BDNF的能力;用ELISA鉴定细胞上清中分泌的BDNF,72h的含量达到最高值,为12.78ng/mL;证明通过构建病毒的感染可以使神经干细胞获得分泌BDNF的能力,且EGFP基因可作为神经干细胞移植研究中良好的示踪剂。结论腺病毒病毒介导EGFP基因及BDNF基因在大鼠胚胎神经干细胞中成功表达,为应用以神经干细胞直接作为基因靶细胞,介导基因治疗中枢神经系统疾病奠定了基础。     

散发性帕金森病α-synuclein基因突变的检测

目的探讨α-synuclein基因已知突变与散发性帕金森病人的关系.方法分离PD组和对照组的外围血基因组DNA,采用α-synuclein基因特异引物对其第四外显子进行PCR扩增,扩增产物用Tsp45Ⅰ酶切鉴定.结果两组PCR均可扩增出216bp的片段,PCR产物不能被Tsp45Ⅰ酶切.结论α-synuclein基因已知点突变与散发性帕金森病可能无明确关系.