HIV检测基因芯片的研制和应用评价

目的研制用于HIV检测的基因芯片,并评价其在临床诊断和出人境检疫中的应用价值。方法针对HIV-1gags基因相对保守区域,设计检测探针,并设计内标和对照探针,制备HIV检测微阵列基因芯片;设计引物,以1：20引物比例不对称扩增HIV基因靶标,Cy3荧光标记扩增产物,作为杂交模板。Cy3荧光标记PCR扩增产物与微阵列探针杂交反应,结果经荧光扫描,并用分型软件分析判断阳性探针和样本HIV阴阳性。采用信号放大、梯度临界值技术,增加了检测的灵敏度和特异性。采用70例临床样本实样检测与DNA测序作对照,评价试剂盒的性能和应用价值。结果70例样本,采用本试剂盒与DNAN序并行检测,两者符合率为98．57％。结论本HIV检测基因芯片试剂盒具有高通量、操作简便、低成本、准确度好等优点,应用研究表明,在临床HIV诊断检测和出入境检测方面具有很高的应用价值。     

耐异烟肼结核杆菌KatG463condon点突变的分子信标快速检测

目的应用分子信标探针检测结核杆菌耐异烟肼kat G463condon点突变,并与测序结果比较以验证该检测方法。方法运用软件对Beacondesigner设计,katG基因包含463condon的分子信标,建立其扩增体系及分子信标芯片检测方法;对扩增产物测序并作比较。结果通过CDC相机观测到结核标准株及耐异烟肼PCR产物与分子信标杂交后荧光信号区别明显;16株耐异烟肼组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐异烟肼组463condon突变检出率为37％,分子信标检测方法与测序法符合率达93％。结论分子信标技术是一种具有高灵敏核酸点突变检测技术;分子信标芯片检测方法与测序法符合率较好。     

耐异烟肼结核杆菌Kat G463condon点突变的分子信标快速检测

目的应用分子信标探针检测结核杆菌耐异烟肼kat G463condon点突变,并与测序结果比较以验证该检测方法。方法运用软件对Beacondesigner设计,katG基因包含463condon的分子信标,建立其扩增体系及分子信标芯片检测方法;对扩增产物测序并作比较。结果通过CDC相机观测到结核标准株及耐异烟肼PCR产物与分子信标杂交后荧光信号区别明显;16株耐异烟肼组与10株H37RV标准株对照组荧光信号强度比较,耐异烟肼组463condon突变检出率为37％,分子信标检测方法与测序法符合率达93％。结论分子信标技术是一种具有高灵敏核酸点突变检测技术;分子信标芯片检测方法与测序法符合率较好。     

HBV多药耐药变异检测试剂的研制和初步评价

目的 研制一种基于反向点杂交技术检测HBV多药耐药变异的核酸检测试剂并对其临床应用进行初步评价.方法 针对HBV P开放阅读框逆转录酶编码区的相对保守序列,设计引物探针,并设计内标和对照探针,制备HBV检测膜条,构建克隆,最后采用已构建好的克隆和50例临床样本进行检测并与测序做比较.结果 克隆和50例临床样本均成功检出...     

线性探针分析法检测结核分枝杆菌rpoB耐药基因突变的研究

目的研制线性探针分析法检测结核分枝杆菌(结核菌)rpoB基因耐药突变试剂盒。方法设计15条结核菌rpoB基因野生型和突变型的线性探针，固定尼龙膜上；在rpoB基因引物上标记生物素，扩增结核菌DNA，获得生物素标记扩增产物，与rpoB基因线性探针杂交，加入标记过氧化物酶的亲合素，再加四甲基联苯胺显色。结果应用线性探针分析法检测87株结核菌，其与rpoB基因直接测序法、传统药敏法符合率分别为98．8％(82／83)和94．3％(82／87)。结论线性探针分析法检测rpoB耐药基因突变是一种操作简便、特异性高、敏感性高，易开展的方法。     

高分辨熔解曲线分析法检测急性髓细胞白血病IDH2基因突变

目的建立高分辨熔解曲线分析(HRMA)技术检测急性髓细胞白血病(AML)中可溶性异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)基因突变。方法针对IDH2突变位点设计PCR扩增引物,建立带有温度内标校准品的PCR扩增体系,对98例AML患者标本进行PCR扩增,用HRMA技术对PCR产物进行突变分析,并通过DNA测序技术对HRMA结果进行验证。结果对98例AML样本的PCR产物进行HRMA检测,发现5例存在异常熔解曲线,对此5例标本及随机选择的HRMA显示为野生型的35例IDH2标本进行DNA测序验证,结果表明,存在异常熔解曲线的5例标本为4例R140Q突变和1例R172K突变,其余35例经DNA测序证实为野生型IDH2;对不同浓度梯度的R140Q质粒HRMA检测结果表明其灵敏度为2%。结论成功建立HRMA技术检测IDH2突变,其可用于AML标本的临床检测。     

PCR-膜芯片检测痰结核杆菌耐药基因突变的应用研究

目的探讨PCR-膜芯片技术直接应用于痰标本中结核杆菌耐药基因突变检测的可行性。方法采集82例痰标本（结核患者64例,非结核患者18例）,TB膜芯片检测标本中的结核杆菌IS6110基因,阳性者利用12对特异性引物进行多重PCR,扩增产物与含有59个探针的耐药-TB膜芯片反向点杂交检测结核杆菌耐药基因突变,测序验证并与药敏试验比对。结果 TB膜芯片检测痰标本中的结核杆菌IS6110基因,特异度为100%（18/18）,灵敏度为81.3%（52/64）,阳性预测值为100%（52/52）,阴性预测值为60%（18/30）;在52例结核杆菌IS6110基因阳性的痰标本中,耐药-TB膜芯片检出INH基因突变的1例,RFP基因突变的1例,INH和RFP基因同时突变的2例,INH、RFP和SM基因同时突变的1例,其中4例结果与药敏及DNA测序结果基本符合,1例突变位点与测序一致,但细菌培养阴性。结论应用PCR-膜芯片技术可提高痰样中结核杆菌基因的检出率;耐药-TB膜芯片检测结果对临床耐药结核病的快速诊断具有重要的参考价值。     

幽门螺杆菌克拉霉素耐药基因芯片的制备和应用

目的 建立一种寡核苷酸微阵列检测幽门螺杆菌23S rRNA基因A2142G、A2143G及C2182T点突变的方法.方法 根据23S rRNA基因A2142G、A2143G及C2182T突变位点设计相应探针,样本经不对称PCR扩增后,其产物与芯片杂交.非荧光标记引物扩增PCR产物克隆至T载体,测序验证芯片结果,并结合临床最低抑菌浓度实验判断该方法的正确性.结果 寡核苷酸微阵列技术与测序检测幽门螺杆菌23S rRNA基因多态性结果完全一致.经培养及鉴定幽门螺杆菌阳性的54份标本,杂交结果显示A2142位点均为野生型(54/54);A2143G突变率为11.11%(6/54),尚未发现A2143C和A2143T的突变;C2182T突变率为12.96%(7/54),尚未发现C2182A和C2182G的突变,其余均为野生型,上述结果与菌株体外试验MIC结果完全一致.结论 建立一种寡核苷酸微阵列技术检测幽门螺杆菌克拉霉素耐药的23S rRNA基因多态性的方法,可以高通量并直接检测胃黏膜而不需进行细菌培养,推动个体化治疗方案的实施.     

反向杂交法检测23种人乳头瘤病毒型别的研究

目的建立一种同时检测人乳头瘤病毒（HPV）5种低危型和18种高危型的反向杂交方法。方法将23种HPV型别（低危型：HPV6、11、42、43和44型，高危型：HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83和MM4型）特异性探针固定于尼龙膜条上，生物素标记的通用引物介导PCR（GP-PCR）扩增HPVDNA，扩增产物与膜条经反向杂交检测HPV型别，并与HC-Ⅱ法及扩增和测序法平行检测136例临床标本，对检测结果进行对比。结果3种方法HPV阳性检出率分别为41．9％、42．6％和加．4％；反向杂交法与后二者检测结果之间均具有良好一致性（Kappa值分别为0．8644和0．9089）；以扩增和测序法为金标准，反向杂交法检测敏感度、特异度和准确性分别为96．36％、95．06％、95．59％。结论本法能一次性检测23种HPV具体型别，敏感度、特异度高，操作简便，结果易于判读，适合临床应用。     

核酸薄膜技术快速检测结核分枝杆菌katG突变的研究

目的研制一种新的核苷酸薄膜,通过导流杂交技术检测结核分枝杆菌katG基因突变类型,以快速判断结核分枝杆菌对异烟肼的耐受性,寻找一种快速简便检测耐异烟肼结核病的方法。方法根据结核分枝杆菌katG基因序列设计1个野生型及2个常见突变型寡核苷酸特异探针,探针5’末端连接亚甲基(-CH2)。同时设计1个人类基因组探针以及1个生物素探针。制作低密度核苷酸薄膜微阵距列,通过导流杂交技术进行杂交,将杂交结果与DNA测序法对照。结果核酸测序显示,突变位点分别出现在包括315位点在内的7个位点,315位点突变占75.0%(18/24),最常见突变形式为AGC315ACC所致Ser315Thr氨基酸改变。杂交结果与测序结果符合率为93.9%(31/33),与DNA测序相比,其阳性预测值、阴性预测值、敏感度、特异度分别为90.0%、100%、100%、86.7%。结论核酸薄膜导流杂交技术能快速、简便、高效地检测临床标本中有无结核分枝杆菌,并可提示结核分枝杆菌有无异烟肼耐药性,指导临床用药。     

治疗前血浆和全血干血斑样品HIV-1 Pol区基因型耐药检测结果比较

目的比较治疗前静脉血浆和全血干血斑(DBS)人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)Pol区基因型耐药检测结果的差异,并分析DBS样品用于HIV-1基因型耐药检测的可行性。方法采集44例HIV-1感染者治疗前静脉全血,分别制备全血DBS样品和血浆样品,提取RNA,检测病毒载量。采用逆转录PCR(RT-PCR)扩增Pol区基因序列,对PCR产物进行Sanger测序,采用Sequencher 5.4.5软件对序列进行清理和拼接,采用BioEdit 7.2软件对参考株序列和样品序列进行比对、系统进化树分析及基因型耐药分析。结果治疗前44例血浆样品检出率100.0%,DBS样品检出30例,检出率为68.2%;24例血浆样品平均病毒载量达到5.02×10⁵IU/mL,中位数为1.76×10⁵IU/mL,DBS样品平均病毒载量为1.46×10³IU/mL,中位数为7.95×10²IU/mL;44例患者HIV-1亚型主要为流行重组株(CRF)07-BC(24/44)、CRF01-AE(16/44);血浆和DBS样品序列相似值100%26例(26/30),相似值99%3例(3/30),相似值97%1例(1/30),其中有6例发生不同程度的耐药突变,DBS样品耐药结果与血浆符合率100%,但在其他位点的突变存在差异。结论治疗前全血DBS样品耐药结果及序列与血浆样品具有高度的一致性,全血DBS样品可用于耐药性检测、HIV-1亚型分析,但检出率比血浆低。     

我国237例未接受抗病毒治疗的HIV/AIDS患者中原发性基因型耐药监测和病毒亚型分析

目的 分析237例HIV/AIDS患者中原发性耐药的发生率和病毒亚型分布情况.方法 从河南、云南、上海等20个地区采集237例未经抗病毒治疗的HIV/AIDS患者血浆HIV-1进行基因测序,通过病毒亚型分析软件REGA HIV-1 Subtyping Tool确定测序样本的HIV-1亚型,并与斯坦福大学HIV耐药数据库比对确定测序样本HIV-1耐药相关突变位点.采用b-DNA方法检测患者血浆病毒载量,采用流式细胞仪检测CD4+ T淋巴细胞计数.结果 237例未接受抗病毒治疗的HIV/AIDS患者感染的HIV-1毒株分布为A1、B、C、CRF01-AE、CRF02-AG、CRY7-BC、CRF08-BC、CRF12-BF、G等9个不同亚型,可能的感染时间分布在1990-2006年.237例患者中仅有3例分别对核苷类逆转录酶抑制剂高度耐药、蛋白酶类抑制剂低度耐药和非核苷类逆转录酶抑制剂高度耐药,原发性耐药的发生率为1.3%(3/237).结论我国部分地区未经抗病毒治疗的HIV/AIDS患者中HIV-1原发性基因型耐药的发生比例处于较低水平,病毒亚型分布在9个亚型.     

HBV基因分型和耐药突变基因检测

目的探讨东营地区乙型肝炎病毒(HBV)基因型分布,乙型肝炎患者耐药情况,HBV基因型别与耐药以及突变位点关系。方法收集乙型肝炎患者血清300例,采用离心柱法提取HBV-DNA,聚合酶链反应(PCR)-反向点杂交法检测HBV分型和耐药突变。结果 300例HBV-DNA阳性患者中,检出B型、C型、B/C型及其他未检测出的基因型,未检出D型分型,检出结果中以C型为主,占81.8%;HBV患者耐药药物以拉米夫定和替比夫定的联合耐药为主,占43.6%;HBV耐药突变基因型主要为rt204I(24.35%)、rt204V(17.39%)及rt180M(17.39%);B型和C型的耐药突变率分别为30.77%和42.42%,差异有统计学意义(P0.05)。结论东营地区HBV基因C型多于B型,C型容易产生耐药,以rt204I,rt204V及rt180M基因突变型多见,拉米夫定和替比夫定的联合耐药多见,应根据基因分型和耐药突变结果对乙型肝炎患者选择适合的治疗方案。     

连接酶反应检测乙型肝炎病毒阿德福韦耐药突变的初步研究

目的建立一种基于连接酶检测反应（LDR）技术的方法,检测慢性乙型肝炎患者阿德福韦（ADV）耐药突变rtA181V／T和rtN236T。方法设计特异性引物和针对不同突变类型的探针,聚合酶链反应（PCR）扩增后进行LDR,最后在测序仪上分析结果。以直接测序法作为对照分析55例临床标本,对结果不一致的标本进行亚克隆测序确认。结果LDR能够在野生型质粒背景下检测到1％的rtA181V／T或rtN236T突变质粒,不与野生型质粒及血清常见病毒产生交叉扩增。55例临床标本中检测到8例（14．5％）rtA181V／T和rtN236T双突变,6例（10．9％）rtA181V／T单突变,7例（12．7％）rtN236T单突变,与直接测序法结果一致的标本有52例（94．15％）。对3例结果不一致的标本进行亚克隆测序分析,结果与LDR一致。结论LDR是一种特异、敏感的方法,可以用于监测慢性乙型肝炎患者ADV耐药突变。     

Molecular characterization of antithrombin III (ATIII) variants using polymerase chain reaction. Identification of the ATIII Charleville as an Ala 384 Pro mutation.

The genes of seven structural mutants of antithrombin III (ATIII), presenting either defective serine protease reactivity or abnormal heparin binding, were analyzed. The polymerase chain reaction (PCR) was used to amplify the corresponding gene exon and the mutation was identified by either dot blot analysis using a battery of allele-specific oligonucleotide probes or sequencing. Variants Paris and Paris 2 were identified as Arg 47 Cys mutations, and Clichy, Clichy 2, and Franconville were found to be Pro 41 Leu mutations. All five are heparin binding-site variants. ATIII Avranches is an Arg 393 His mutation and ATIII Charleville is an Ala 384 Pro mutation. These two mutations impair the reactive site of the molecule. ATIII Charleville is a new mutation of the reactive center, as predicted by previous biochemical data. The position of this new mutation, together with the other previously described mutations of the reactive center, sheds light on the molecular function of this site in inhibiting thrombin. Finally, genomic amplification by PCR is a powerful technique for the fast identification of antithrombin III mutations and their homozygous/heterozygous status, and should be useful for predicting thrombotic risk.