PCR检测诊断罗非鱼荧光假单胞菌病技术的建立

根据基因库荧光假单胞菌的16S-23S rDNA基因序列设计一对特异性引物,用PCR对4株鱼荧光假单胞菌进行扩增。特异性结果显示该对引物对4株荧光假单胞菌均扩增出与预期大小相一致的428bp的扩增产物,而对罗非鱼嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、罗非鱼迟缓爱德华氏菌、斑点叉尾鮰钻鱼爱德华氏菌、柱状嗜纤维菌、链球菌、葡萄球菌、河弧菌、大肠杆菌和沙门氏菌等10种病原体的扩增,结果全为阴性。该PCR敏感性结果表明可以检测到1pg的荧光假单胞菌DNA模板。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT—PCR检测禽呼肠孤病毒δC和δNS基因方法的建立

为建立一种定量检测禽呼肠孤病毒δC和8NS基因的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法,针对δC、δNS基因分别设计了1对特异性引物,同时选择了1对内参基因B—actin引物,将常规PCR扩增的片段分别连接到pMD18－T载体上构建重组质粒,经筛选、鉴定纯化后,梯度倍比稀释作为标准品,用于构建SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测δC、δNS基因及内参基因β—actin的标准曲线。结果表明,建立的标准曲线具有良好的线性关系,R^2均在0．99以上;最小检出量为10拷贝／μL的阳性标准品,且具有良好的重复性,能够校正抽提样品中细胞数量不均带来的差异。可见,SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR方法能满足检测微量样品中禽呼肠孤病毒δC和δNS基因表达的要求,具有快速、敏感性高、重复性好等特点。     

罗非鱼荧光假单胞菌的分离鉴定

从发病罗非鱼中分离获得1株革兰氏阴性杆菌,依据细菌形态、培养、生理生化特性初步鉴定为荧光假单胞菌,结合PCR检测、克隆测序及Blast比对分析,进一步确定该分离菌株为荧光假单胞菌。致病性试验结果显示,该分离菌株具有较高的致病性,能引起罗非鱼发病、死亡,其病理变化与荧光假单胞菌引起的鱼类赤皮病完全相似。药敏试验结果显示,该分离菌株对氟哌酸、氧氟沙星、新霉素高度敏感,但对氨苄青霉素、青霉素、阿莫西林等不敏感。     

贝类单孢子虫荧光定量PCR检测方法的建立

根据基因库中单孢子虫的基因保守序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,对反应条件和试剂浓度进行优化,建立了检测单孢子虫的荧光定量PCR方法。该方法对单孢子虫的检测敏感性达到40拷贝数,比常规PCR敏感性高100倍;对派琴虫、折光马尔太虫、荧光假单胞菌、副溶血弧菌、溶藻弧菌、河弧菌和拟态弧菌等病原体的检测结果全为阴性。表明该研究建立的单孢子虫荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量和重复性好等优点,可用于临床单孢子虫感染的快速检测。     

H5亚型禽流感病毒RT-LAMP可视化检测技术的建立

【目的】建立一种适用于H5亚型禽流感病毒（AIV）的逆转录环介导等温扩增（RT-LAMP）可视化快速检测技术,为控制疫情扩散、减少经济损失争取了时间。【方法】根据GenBank中H5亚型AIV血凝素（HA）基因序列,设计一套针对HA基因6个区域的4条特异性引物,在反应之前向反应液中加入荧光试剂（Calcein／MnCl2混合液）,然后对反应条件和体系进行优化。【结果】优化的RT-LAMP技术操作简便迅速,常规水浴锅中50min可完成,能特异性地检测出H5亚型AIV,但对其他HA亚型AIV、禽呼吸道病原体无交叉扩增反应,灵敏度是常规RT-PCR的10倍;反应结束后无需打开反应管盖,即可根据反应液的颜色变化对结果进行判定。【结论】建立的H5亚型AIVRT-LAMP可视化检测技术具有简便、快速、特异等特点,可在设备有限的基层兽医站及养殖场对H5亚型AIV进行快速初步诊断。     

禽流感病毒H1、H3亚型和M基因三重PCR检测方法的建立

【目的】建立用于检测禽流感病毒（Avianinfluenzavirus,AIV）且能同时区分H1和H3亚型AIV的方法,为有效防控禽流感（Avianinfluenza,AI）奠定基础。【方法】根据H1亚型、H3亚型AIV-HA基因和M基因的保守核苷酸序列,分别设计3对特异性引物,以含有H1亚型AIV和H3亚型AIV的cDNA为模板,对三重PCR扩增条件进行优化,验证其特异性和敏感性,并对临床样品进行AIV检测。【结果】H1和H3亚型AIV混合模板经三重PCR扩增可获得3条特异性条带,其中302bp为H1亚型HA基因、453bp为M基因、626bp为H3亚型HA基因;含有H1或H3亚型AIV的模板均出现两条特异性条带,大小分别为302和453bp、453和626bp;含有其他亚型AIV的模板仅出现一条特异性条带（453bp）;而其他禽呼吸道疾病病毒均未扩增出任何条带。优化后的三重PCR最低能同时检测出7.00pg的H1亚型AIV、3.62pg的M基因和20.60pg的H3亚型AIV;对100个临床样品进行AIV检测,AIV总阳性率为36%,其中H1亚型阳性率4%、H3亚型阳性率9%、其他亚型阳性率23%。【结论】禽流感病毒H1、H3亚型和M基因三重PCR检测方法具有快速、敏感、特异等特点,适用于AIV的检测及H1和H3亚型AIV的分型检测。     

H5N1亚型AIVHA抗原表位的高效表达及其抗原活性分析

血凝素（hemagglutinin,HA）蛋白是禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的一个重要表面抗原性蛋白,在疾病诊断和防治上有重要意义。本研究为了探讨一种更为简便有效的HA重组蛋白表达途径,利用生物信息学软件,对H5N1亚型AIVHA基因编码的氨基酸序列进行分析,在分析其在大肠杆菌中的密码子偏好性、稀有密码子分布情况及有关蛋白的抗原性等重要特性后,构建了HA抗原表位重组表达质粒pET-32a（＋）-HA。经测试,该重组质粒在1mmol/LIPTG诱导剂作用下诱导过夜,能在大肠杆菌Rosetta-gami B（DE3）中高效表达,并得到48.1kD大小的目的重组表达蛋白。重组蛋白用6×His-tagged protein纯化试剂盒纯化后,与福氏佐剂等量混合制备成抗原,以200μg/鸡的剂量皮下注射2月龄SPF鸡3次,采血分离血清。Western-Blot试验结果表明,该重组表达蛋白能分别与所制备的高免鸡血清及H5N1亚型AIV阳性血清发生特异性反应,在硝酸纤维素膜上出现特异性杂交带。说明本试验研究的HA抗原重组表达蛋白具有良好的免疫原性和反应原性,保留了HA蛋白的抗原活性,提示该重组蛋白在H5亚型AIV的防治技术研究中具有重要的实际应用价值。     

禽呼肠孤病毒σB和σC蛋白在昆虫细胞中的共表达

本研究旨在获得具有天然构象和活性良好的禽呼肠孤病毒（ARV）σB和σC蛋白,采用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中共表达σB和σC蛋白,并对其活性进行鉴定。根据NCBI数据库中ARV σB和σC基因序列设计引物,将两个基因克隆至pFast-Dual载体,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞,筛选获得重组穿梭杆粒。通过转染sf9细胞,筛选到含有σB和σC基因的重组病毒。将重组病毒感染sf9细胞,通过优化接毒量和收获时间等参数,确定最佳表达条件,在sf9细胞中高效共表达σB和σC蛋白。Western blotting和间接免疫荧光（IFA）检测结果表明,成功在sf9细胞中共表达了ARV σB和σC蛋白,并具有很好的生物学活性。本试验结果为开发鉴别诊断试剂以及ARV颗粒疫苗的研究奠定了基础。     

3株鸡传染性贫血病毒的全基因组序列分析

通过对3株鸡传染性贫血病毒(CIAV)的全基因组序列比较分析,部分表明广西南宁鸡群CIAV毒株的遗传变异特征。将阳性CIAV的组织样品进行DNA抽提后,运用PCR方法分段扩增CIAV的全基因组,将获得的PCR产物进行基因克隆并进行阳性克隆菌鉴定后送测序。将所获得的基因序列进行拼接成CIAV基因组全长后,应用LaserGene7.1和MEGA4.1软件对CIAV全基因、Viral protein 3(VP3)、Viral protein 1(VP1)和Viral protein 2(VP2)基因序列进行核苷酸、氨基酸同源性分析和遗传进化分析;并对VP1、VP2和VP3蛋白上与毒力、蛋白磷酸酶活性和细胞凋亡相关的氨基酸位点进行分析。结果获得3株CIAV的全基因序列,分别命名为GX1801、GX1804和GX1810;CIAV全基因遗传进化分析表明GX1801、GX1804和GX1810均同属于Group A群,与国内强毒株GD-103和GD-104毒株的亲缘关系较近;基于VP1基因构建的遗传进化树与全基因构建的进化树最相似;GX1801、GX1804和GX1810 VP1蛋白上与毒力相关位点的第75、89、125、141、144、394位氨基酸位点与日本强毒株C368株、国内强毒株GD-103和GD-104株在同一位点保持一致;GX1801、GX1804和GX1810 VP2蛋白上与磷酸酶活性相关的基序(I^94CNCGQFRKH^103)均未发生变异;GX1801、GX1804和GX1810 VP3蛋白与诱导细胞凋亡相关的重要区域(VP3蛋白N端结构域的第1~69位氨基酸)均高度保守。本研究对3株CIAV全基因组进行测定并进行基因分析,获得了其基因组特征,为进一步研究广西CIAV的分子流行和致病性提供参考。     

禽白血病病毒和鸡传染性贫血病毒二重荧光LAMP检测方法的建立及应用

【目的】建立同时鉴别ALV和CIAV的二重荧光环介导等温扩增（LAMP）检测方法,为临床上快速诊断及有效防控ALV和CIAV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考ALV （A亚群、B亚群、C亚群、D亚群和J亚群）的pol基因和CIAV的VP2基因保守序列,设计2套用于LAMP的特异性引物,并在ALV和CIAV的F1c和B1c覆盖区域分别设计双标记探针[ALV-Probe （5'端标记FAM荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团）和CIAV-Probe （5'端标记CY5荧光基团,3'端标记BHQ3淬灭基团）]。在Loopamp LA-320C实时浊度仪中反应结束后,将反应管置于多色荧光系统内进行观察分析;并通过特异性试验、灵敏度试验及临床样品检测验证二重荧光LAMP检测方法的适用性和可靠性。【结果】优化后的二重荧光LAMP反应体系20.0μL:DNA/cDNA模板2.0μL,2×Reaction Mix 10.0μL,Bst DNA聚合酶0.8μL,内引物ALV-FIP、ALV-BIP、CIAV-FIP和CIAV-BIP （工作浓度40.0μmol/L）各0.8μL,外引物ALV-F3、ALV-B3、CIAV-F3和CIAV-B3（工作浓度5.0μmol/L）各0.4μL,ALV-Probe （工作浓度0.5μmol/L）0.4μL,CIAV-Probe （工作浓度0.5μmol/L）0.8μL,以ddH₂O补足至20.0μL。扩增程序:62℃反应60 min,80℃灭活5 min。建立的二重荧光LAMP检测方法能特异性同时检测ALV和CIAV,对其他禽类病原体无特异性扩增;检测CIAV和ALV单一模板的下限均为102拷贝/μL,检测混合模板时ALV的检测下限为102拷贝/μL、CIAV的检测下限为103拷贝/μL。应用建立的二重荧光LAMP检测方法对13份咽喉和泄殖腔棉拭子样品进行检测,其检测结果与常规PCR检测结果的吻合率达100%。【结论】建立的二重荧光LAMP检测方法能实现在同一反应管内鉴别诊断ALV和CIAV,具有特异性好、敏感性高及污染风险小等优点,且检测结果可通过多色荧光系统进行肉眼观察,适用于ALV和CIAV的临床快速筛查。