三种鉴别诊断PRRSV美洲型经典毒株和变异株的方法比较

我国流行的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）包括美洲型经典毒株和变异株。本研究应用RT—PCR、直接免疫荧光（ direct immunofluorescence asay, DFA ）及病毒分离3种检测方法对99份不同类型的猪繁殖与呼吸综合征临床疑似病料和人工感染病料进行检测。结果显示,RT—PCR检测试剂盒敏感性最高,DFA鉴别诊断试剂盒次之,病毒分离最差。DFA与病毒分离、RT—PCR的总符合率分别为92％和85．5％。RT—PCR灵敏性高,可作为PRRSV鉴别诊断的首选方法;DFA鉴别诊断法所需时间较短、特异性好,但需要一定的操作经验;病毒分离敏感性低、操作繁琐,阳性分离需要其它方法验证,不适合于PRRSV的鉴别诊断。     

2007-2010年江苏地区猪繁殖与呼吸综合征病毒RT-PCR检测及部分Nsp2基因序列分析

本研究参考GenBank已发表的猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp2基因序列,在高致病性病毒Nsp2基因缺失区的两端保守区设计并合成了一对引物,建立并优化了能够区分经典PRRSV和高致病性PRRSV的RT-PCR诊断方法,并利用该方法对2007～2010年间江苏地区的45份可疑临床病料进行了检测。结果表明临床病料阳性率为40％,所有毒株均属于高致病性毒株。对PRRSV阳性病毒的Nsp2基因序列分析表明,所有18株PRRSV均属于美洲型毒株,与中国高致病性PRRSV代表毒株JXA1、WUH1的氨基酸同源性分别在82．2％～97．6％、80．4％～95.3％。此外,18株病毒的Nsp2共同存在不连续的30个氨基酸缺失,缺失位置与同期中国高致病性PRRSV具有相同的特征。通过本研究掌握了江苏地区2007～2010年间PRRSV流行情况及Nsp2基因变异特征,为地方猪繁殖与呼吸综合征的临床诊断和防治提供参考依据。     

非洲猪瘟病毒环介导恒温扩增快速检测技术的建立及应用

本研究基于非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）vp72基因设计引物,建立了能够快速检测非洲猪瘟病毒的环介导恒温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）。将LAMP与OIE参考的PCR检测方法进行比较,并且应用LAMP对非洲猪瘟参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组以及国内收集的50份猪的基因组、30份蜱的基因组进行检测。结果显示,本研究设计的引物具有良好的特异性和敏感性,所建立的LAMP能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组,而野外收集的猪和蜱的基因组检测均为阴性。因此,本研究所建立的方法能够用于非洲猪瘟的快速诊断以及防控。     

TTMV间接ELISA检测方法的建立

以TTMV重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了检测人TTMV血清抗体的间接ELISA方法,结果显示：抗原最佳包被浓度为1．63μg／mL,37℃孵育1h后4℃过夜;血清稀释度为1：320;酶标二抗孵育时间为37℃60min;ELISA酶标板的临界值为0．211。运用该方法对上海市和辽宁省共计280份血清样品进行检测,阳性检出率分别为34．68％和39．74％。检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性与重复性均较好,为进一步完善TTMV临床诊断方法打下了基础。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒RNA聚合酶基因的克隆及原核表达

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV-Ⅰ）ZJ-Ⅴ株基因组序列（GenBank登录号：EF382778）,设计了一对扩增RNA聚合酶基因（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）的特异性引物,以ZJ-Ⅴ株基因组为模板,扩增DHV-Ⅰ的RdRp基因。运用DNAStar软件对ZJ-Ⅴ株病毒与GenBank上已发表的其他不同DHV毒株的RdRp基因序列进行同源性比较和遗传进化分析,结果表明,ZJ-Ⅴ株与A型DHV-ⅠR85952株（DQ226541）的同源性为97.1%,亲缘关系最近,与2株台湾新型（B型）DHV之间为76.9%和77.0%,与C-GY株和4株韩国新型（C型）DHV株之间为76.2%~76.5%,亲缘关系较远。将RdRp基因克隆至原核表达载体pET-32a（＋）,获得重组表达质粒pET-RdRp,转化宿主菌E.coli BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析结果显示RdRp蛋白分子量约为65 kDa,Western blot检测证明RdRp蛋白能与Ⅰ型鸭病毒性肝炎阳性血清产生特异性免疫反应,具有良好的免疫学活性。本文为进一步研究DHV-Ⅰ的复制机理奠定了基础。     

PCR检测猪输血传播病毒Ⅱ型方法的建立及其应用

根据GenBank中猪源输血传播病毒Ⅱ型（Swine torque teno virus genogroupⅡ,TTVⅡ）基因序列设计并合成了1对特异性引物,扩增468bp目的片段。将PCR扩增产物测序,结果与GenBank中猪TTVⅡ型基因序列同源性为95%。利用该方法对猪圆环病毒Ⅱ型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪链球菌、猪多杀性巴氏杆、猪霍乱沙门菌和大肠杆菌等病原核酸进行扩增,均无条带出现,表明该方法具有较高的特异性。该方法的灵敏性试验表明,最低能检测到10.2pg核酸。利用所建立的PCR方法检测来自我国华南地区192份临床样品,阳性率为21.4%（41/192）。     

1％阿维·鱼藤新型乳油防治柑橘红蜘蛛田间药效试验

采用1％阿维·鱼藤新型乳油对柑橘红蜘蛛进行田间药效试验。结果表明,1％阿维·鱼藤新型乳油500、1000和1500倍液3个处理对活动螨态均具优异的杀灭效果,药后1d,500倍液处理组防效显著高于对照药剂200阿维·哒3000倍液处理,二者各为99．70%±0．30％和93．64%±2.29％;药后5d,1％阿维·鱼藤新型乳油500、1000和1500倍液3个处理对活动螨态的防效与对照药剂相当,4者防效均高达94．72％以上。此外,1％阿维·鱼藤新型乳油1500、1000和500倍3个处理均对柑橘红蜘蛛螨卵具一定的杀卵效果,其中500倍处理组的杀卵作用较好,校正杀卵率达80．59%±2．51％。     

7种除草剂对红麻田杂草的防除效果和安全性

通过对7种不同除草剂防除红麻福红991田杂草的筛选试验,结果表明,敌草胺、乙草胺、精异丙草胺等7种除草剂对红麻田杂草株防效和鲜重防效差异均不显著,对杂草株防效达到78%~98%,对杂草鲜重防效达到77%~98%。48%氟乐灵EC对福红991的安全性最好,福红991植株鲜重达到3.35 kg/m2。     

GAPB基因原核表达载体的构建

以拟南芥cDNA为模板,用PCR扩增出GAPB的基因全长,然后将GAPB基因片段连接到PET28a（＋）载体上,构建重组质粒并转化大肠杆菌DH5α,经菌落PCR和酶切鉴定筛选出阳性克隆,测序正确后,再将阳性克隆的质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）。结果表明：成功构建了原核表达载体PET28a（＋）-GAPB,为后续的G...     

胶体金试纸条法和液相色谱-串联质谱法检测牛奶中四环素类药物残留比较

采用胶体金试纸条与液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）两种方法检测牛奶中残留的四环素类药物。结果表明：胶体金试纸条的检测限为四环素40μg/L、强力霉素40μg/L、金霉素40μg/L、土霉素80μg/L;LC-MS/MS法在牛奶中四环素、强力霉素、金霉素、土霉素的检测限为50μg/L。采用两种方法对实际样品检测,检测结果一致。与液相色谱-串联质谱法相比,胶体金试纸条具有操作简便、快速、直观的特点,可作为筛选法对样品进行定性筛查,LC-MS/MS法进行阳性样品的确证和精确定量。