杆状病毒新的分类地位和书写方式

2020年10月ICTV更新了主要病毒名录，该文件新增了纳尔达病毒纲Naldaviricetes和勒乏病毒目Lefavirales。勒乏病毒目含中有包括杆状病毒科Baculoviridae在内的3个科，而杆状病毒科分为4个属：甲型杆状病毒属Alphabaculovirus、乙型杆状病毒属Betabaculovirus、丙型杆状病毒属Deltabaculovirus和丁型杆状病毒属Gammabaculovirus，该名录中杆状病毒科有85个主要种。根据ICTV网站病毒名称和种名的书写规范，杆状病毒的种名由其宿主昆虫的种名和病毒特性词（如nucleopolyhedrovirus和granulovirus）组成，其中宿主昆虫的属名首字母大写，其余字母均小写。病毒的种名（在用于系统分类时）书写全部用斜体，但其他情形时病毒名称（包括其宿主的属和种名）均采用正体书写。杆状病毒名称的缩写一般采用宿主属名和种名的前两位双字母＋病毒特性词缩写的方式，但16种传统杆状病毒的缩写仍沿用宿主的属名和种名首位单字母＋病毒特性词的缩写的方式。     

口蹄疫病毒非结构蛋白2C基因在昆虫细胞中的表达及应用

研究口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白(NSP) 2C在区分灭活疫苗免疫动物与自然感染动物方面的意义.本研究将FMDV NSP 2C基因,克隆到穿梭载体pFast-bac- HT-B,将其转入含骨架载体Bacmid的DH10Bac,经蓝白斑筛选得到重组骨架质粒Bacmid-2C.将Bacmid-2C转染昆虫细胞Sf9,鉴定正确后,经3次增殖获得高滴度的P-3代病毒后,在High Five细胞中进行目的蛋白的表达.SDS-PAGE结果显示在High Five细胞中得到了相对分子质量约为38.93 ku的目的蛋白2C,Western blotting及Dot-ELISA结果显示,该表达产物对FMDV感染动物阳性血清有良好的反应性.以电泳纯化的2C蛋白为抗原建立间接ELISA,检测健康非免疫动物、免疫动物及FM-DV试验感染动物血清,结果表明2C-ELISA不但能区分免疫动物和感染动物的血清,而且还能检测FMDV感染早期动物血清中的2C抗体.说明昆虫细胞表达的2C蛋白可作为FMDV疫苗免疫动物与自然感染动物鉴别诊断的良好抗原.2C基因在Bac-to-Bac系统中的成功表达为建立通过检测几种NSP抗体,筛查感染及隐性带毒动物,净化畜群的方法奠定了基础.     

昆虫质型多角体病毒与杆状病毒多角体的结构比较

依据已有的研究结果,分析比较昆虫质型多角体病毒和杆状病毒多角体的结构差异。2种病毒都产生多角体,其中质型多角体病毒多角体的原子结构展现一个错综复杂的三聚体组装,即通过多角体蛋白分子突出的N-端螺旋臂互相连接在一起;杆状病毒和质型多角体病毒的多角体晶体相似,蛋白序列的N-末端也是α-螺旋。由此表明这2种病毒的多角体蛋白及其共同结构基础具有同源性。但一些研究表明质型多角体病毒和杆状病毒的多角体基础分子组织形成不同。尽管这2种病毒多角体含有相近的结构单位及共有对称方式,但是多角体分子在结构上差别较大,在晶体内的组装形式也不同,特别是二硫键和N-端区域的区域交叉使杆状病毒多角体的晶体构造稳定坚固,C-端臂使其结构单位相互连接在一起。有研究表明N-末端螺旋突出臂在杆状病毒和质型多角体病毒中也具有不同的结构功能,但目前并没有结构方面的证据证明这2种病毒多角体具有共同的进化起源。     

利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统在家蚕中表达人瘦素蛋白

瘦素(leptin)蛋白由肥胖基因编码,对人体能量代谢等多种生理过程起着重要的调节作用。利用Bac-to-Bac杆状病毒表达系统,将人瘦素蛋白基因(lep)克隆到杆状病毒转移载体pFastBacHTb,并转化E.coli DH10Bac,获得重组杆粒Bacmid-lep,然后转染家蚕BmN细胞,获得重组杆状病毒。用SDS-PAGE和Western blotting方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞检测到大小约22 kD的蛋白条带,与预期的人瘦素蛋白分子质量相符。给家蚕5龄起蚕注射重组病毒液后的4～5 d出现发病症状,RT-PCR检测发病家蚕的血液中有lep基因转录,并通过SDS-PAGE和Western blotting检测到大小为22 kD的人瘦素蛋白的表达。研究结果表明,利用Bac-to-Bac表达系统能够获得含有人瘦素蛋白基因的重组杆状病毒,并且目的蛋白能在家蚕细胞及幼虫体内表达。     

J亚群禽白血病病毒gp85基因在重组杆状病毒中的表达及鉴定

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-J)的gp85蛋白,将ALV-J的gp85基因克隆至pFastBac-HTA供体质粒,将其转入DH10BacTM大肠杆菌感受态细胞,使gp85基因整合到Bacmid穿梭载体中,构建重组穿梭载体Bacmid-gp85。通过脂质体介导,将重组穿梭载体Bacmid-gp85转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rBacgp85。Western-blot和间接免疫荧光试验(IFA)鉴定结果表明ALV-J gp85蛋白在Sf9昆虫细胞中得到正确表达,表达的重组gp85蛋白分子量约为38 ku。ALV-J gp85重组蛋白在Sf9细胞中的正确表达为其功能研究和应用提供了良好的基础。     

H5N1亚型禽流感病毒血凝素在昆虫杆状病毒系统中表达与活性鉴定

摘要：本实验从质粒pGEM-HA中扩增H5N1亚型禽流感病毒HA基因，构建转移载体pFastBacHT-HA并与E.coliDH10Bac中的Bacmid质粒重组，构建重组转座质粒rBacmid-HA。在脂质体介导下将rBacmid-HA转染sf9昆虫细胞获得重组杆状病毒。在sf9昆虫细胞中表达HA蛋白，通过SDS-PAGE、Western blot和血细胞吸附实验鉴定重组蛋白。结果显示重组HA蛋白分子量约为66kDa，该蛋白与AIV H5亚型鸡血清发生特异性反应，与H7、H9亚型鸡血清不反应，转染重组杆状病毒后的细胞能吸附鸡的红血球，证明HA基因在sf9昆虫细胞中获得了正确表达，不仅具有型特异性，而且有良好的生物反应性。     

人内皮抑素在家蚕细胞和幼虫中的表达

将人内皮抑素（Endostatin）基因重组于家蚕杆状病毒转移载体pBacPAK8中，获得重组转移载体pBacPAK-Endo，并与修饰性线性化病毒Bm-BacPAK6DNA共转染家蚕培养细胞，二者在细胞内发生内源重组，经蓝白斑筛选及DNA点杂交，鉴定出含有Endostatin基因的重组病毒BmBac-Endo。将重组病毒感染家蚕培养细胞和五龄幼虫，经SDS－PAGE电泳、Western blotting分析及对人血管内皮细胞株ECV304的抑制活性测定，证明Endostatin在家蚕细胞和幼虫中得到高效表达，且表达产物具有良好的生物学活性。     

SARS-COV S蛋白在大肠杆菌和家蚕中的表达

将SARS-CoV S蛋白基因的部分序列(accession number为AY304495的22 908-23 542 nt区域),克隆到表达载体pET28 a(+)中,并在大肠杆菌BL21中诱导表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,重组S蛋白的分子量约为27 kD,与理论分子量相符。将S蛋白基因的部分序列克隆入杆状病毒转移载体pBacPAK-H is后,与线性化家蚕杆状病毒BmBacPAK-6共转染BmN细胞,经空斑筛选获得重组杆状病毒BmBac-S,并将其在细胞和家蚕中进行表达。SDS-PAGE、W estern b lotting分析表明,表达产物的分子量约30 kD,用金属螯合亲和层析纯化得到家蚕细胞表达的重组S蛋白。     

肾型传染性支气管炎病毒M基因的遗传分析及其在杆状病毒表达系统中的表达

对肾型鸡传染性支气管炎病毒分离株Ck/Jiangsu/DS10/2008株(DS10株)膜蛋白(M)基因进行扩增、克隆和序列测定,并与GenBank中的其它25株参考株的M基因进行比对分析并构建进化树,研究其遗传进化关系。另将M基因克隆至杆状病毒表达系统pFastBac1载体并转染Sf9昆虫细胞进行表达,经间接免疫荧光鉴定,用琼扩试验验证表达产物的反应性,以研究M基因表达产物的生物学活性。测序结果表明DS10的M基因全长为678bp,编码225个氨基酸。遗传进化分析表明,DS10病毒与其它不同致病型的传染性支气管炎病毒共属同一大分支。间接免疫荧光检测表明,M蛋白在Sf9细胞中得到表达,琼扩试验验证表达产物具有良好的反应性,以上结果表明所表达的M蛋白具有良好的生物学活性。本研究表达的M蛋白可为其生物学活性研究及其诊断抗原、新型疫苗开发提供基础材料。