利巴韦林脂质体在大鼠体内的药物动力学及其生物利用度

应用高效液相色谱法 ,以市售利巴韦林口服液为对照 ,测定了利巴韦林脂质体灌胃给药后大鼠血清中的药物浓度 ,按非隔室模型计算利巴韦林脂质体的药物动力学参数 ,AUC值为1 1 1 2 6μg·h/mL,MRT值为 2 1 6h ,K值为 0 0 61 /h ,其相对生物利用度为 1 2 1 3 %     

小鼠胚胎干细胞来源平滑肌细胞的鉴定及其功能分析

背景:胚胎干细胞来源的平滑肌细胞是血管组织工程潜在的细胞来源之一,但这些细胞是否具有成熟平滑肌细胞的表型和功能仍不清楚.目的:对小鼠胚胎干细胞分化的甲滑肌细胞进行表型鉴定及功能分析.设计、时间及地点:细胞学体外观察,于2007-05/2008-12在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成.材料:清洁级孕12.5 d昆明小鼠1只用于制备饲养层细胞,SD大鼠1只用干制备主动脉平滑肌细胞.小鼠胚胎干细胞系R1、小鼠微血管内皮细胞系由美国ATCC公司提供,转染pSPIE载体的胚胎干细胞R1由本实验室制备.方法:①诱导分化及筛选:用转染pSPIE载体的胚胎干细胞R1制备拟胚体,拟胚体悬浮培养5 d后贴壁培养1 d,第7天加入全反维甲酸诱导分化4 d,第11大用10 mg/L嘌呤霉素对诱导分化后的细胞筛选2 d.②表型鉴定:对筛选到的平滑肌细胞进行SM α-actin、SM22a、SM.MHC免疫荧光染色,以大鼠原代主动脉平滑肌细胞、未经筛选的第10天分化细胞作为对照,进行Western Blot分析.③收缩功能:10-5 mol/L卡巴可处理筛选到的平滑肌细胞30 min.④体外成血管功能:将等量的内皮细胞和筛选到的平滑肌细胞混合,在Matrigel上培养.主要观察指标:平滑肌细胞标志物的表达,平滑肌细胞的收缩,平滑肌细胞向内皮管腔样结构的募集.结果:分化的平滑肌细胞上要分布于贴壁生长的拟胚体的外周部位,胚胎干细胞来源的平滑肌细胞3种标志物SM α-actin、SM22a、SM-MHC免疫荧光染色均呈阳性表达,Western Blot结果显示其SM α-actin、SM22a表达水平与大鼠原代主动脉平滑肌细胞相似,高于未经筛选的第10天分化细胞.筛选剑的平滑肌细胞在10-5 mol/L卡巴可刺激下出现明显收缩,且能够募集到内皮管腔样结构周围.结论:小鼠胚胎干细胞来源的平滑肌细胞具有与成熟平滑肌细胞相似的表型和功能.     

ALOX5AP基因T(-1340)G多态性与中国北方汉族人群冠状动脉粥样硬化性心脏病发病的关联

目的:探讨编码5-脂氧合酶激活蛋白FLAP的基因ALOX5APT(-1340)G多态性与中国北方汉族人群冠心病发病的相关关系.方法:选自2006-01/2007-09在解放军沈阳军区总医院行选择性冠状动脉造影者共680例.根据造影结果分为冠心病组336例均为选择性冠状动脉造影阳性,对照组344例为造影阴性或动脉管腔狭窄<50%且临床上无相关心肌缺血证据者.在随机选择的无亲缘关系的48名中国北方汉族个体中,采用聚合酶链反应-重测序法对ALOX5AP基因进行单核苷酸多态的筛查,共发现7个多态.冠心病组和对照组受试者采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法检测ALOX5AP基因T(-1340)G多态性位点在两组间的基因型和等位基因分布.结果:ALOX5AP基因T(-1340)G3种基因型(TT型,TG型和GG型)在冠心病组分布频率分别为26.79%,51.79%和21.43%,在对照组分别为33.72%,47.38%和18.90%,两组间的基因型分布皆符合Hardy-Weinberg平衡定律,3种基因型在两组间的分布差异无显著性意义(x~2=3.90,P>0.05).G等位基因在两组间的分布频率为47.32%和42.59%,差异无显著性意义(x~2=3.08,P>0.05).按性别分层进行亚组分析,发现ALOX5AP T(-1340)G多态的基因型和等位基因频率在冠心病组和对照组间的比较差异无显著性意义.结论:5-脂氧合酶激活蛋白基因ALOX5AP T(-1340)G多态性与中国北方汉族人群冠心病发病可能无相关关系.     

平滑肌细胞纯化载体构建及在小鼠胚胎干细胞中的表达

背景:胚胎干细胞是平滑肌细胞重要的来源之一,但是胚胎干细胞分化细胞的异质性导致难以获得较纯的平滑肌细胞.目的:为进一步纯化胚胎干细胞来源的平滑肌细胞,拟在体外构建平滑肌特异性SM22α启动子驱动的嘌呤霉素抗性(puromycin acetyltransferase,pac)基因与增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein,EGFP)基因双表达载体,即pSM22-PAC-IRES2-EGFP载体,并在胚胎干细胞中检测其有效性及特异性.设计、时间及地点:基因水平细胞观察实验,于2007-05/2008-09在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成.材料:小鼠胚胎干细胞系R1购自美国ATCC公司,编号SCRC-1011~(TM).pSM22α-EGFP载体由本实验室构建;pIRES2-EGFP载体、pSM2C载体、pSuper.basic载体购自Invitrogen公司.方法:用聚合酶链反应方法从pSM22α-EGFP中扩增SM22α启动子,然后用该启动子替换pIRES2-EGFP载体中的CMV启动子,构建pSM22-IRES2-EGFP.再从pSM2C中用HindⅢ/Cla Ⅰ酶切获得pac基因,将pac基因片段亚克隆到pSuper.basic中,构建pSuper-PAC.最后BgⅢ/Acc Ⅰ双酶切pSuper-PAC获得pac基因片段,将其插入到pSM22α-IRES2-EGFP,构建成pSM22α-PAC-IRES2-EGFP.将pSM22α-PAC-IRES2-EGFP用脂质体法转染胚胎干细胞,G418筛选阳性克隆.诱导胚胎干细胞阳性克隆分化,RT-PCR扩增pac基因鉴定阳性克隆.对分化细胞行平滑肌细胞标志物SMα-actin免疫荧光染色.主要观察指标:①pSM22α-PAC-IRES2-EGFP测序结果.②pac基因扩增.③荧光显微镜下同时观察分化细胞EGFP的表达及SMα-actin染色情况.结果:HindⅢ/Cla Ⅰ双酶切得到261 bp,664 bp,5 000 bp 3个片段,与预期结果一致,测序结果证实pSM22α-PAC-IRES2-EGFP构建成功.Pac基因扩增证实有4株胚胎干细胞克隆转染成功.转染成功的胚胎干细胞被诱导分化后,部分细胞表达EGFP,且这些细胞SMα-actin染色呈阳性.结论:实验成功构建了平滑肌细胞筛选载体pSM22α-PAC-IRES2-EGFP.成功转染这一载体的胚胎干细胞表达pac基因及EGFP基因,且EGFP表达具有平滑肌特异性.     

纸色谱-紫外分光光度法测定脂质体中酮洛芬的含量

人工培植牛黄灌胃给药对巴豆油致小鼠耳肿胀,角叉菜胶致大鼠足肿胀,胸膜炎模型大鼠白细胞游走均有显著抑制作用,对ACCB抗炎作用的机制进行了初步探讨。结果显示,ACCB灌胃给药能显著降低大鼠角叉菜胶性炎症渗出物中丙二醛（MDA）含量,降低胸膜炎模型大鼠胸积液中一氧化氮（NO）含量,显著增强超氧化物歧化酶（SOD）的活力。     

E1A激活基因阻遏子促进人血管内皮细胞VEGF分泌和单层通透性增加

目的: 探讨E1A激活基因阻遏子(CREG)诱导的人血管内皮细胞(ECs)单层通透性改变中的作用及机制。方法: 用CREG过表达及CREG表达下调的ECs为模型,Transwell chamber弥散模型观察ECs单层通透性的改变; 荧光倒置显微镜观察细胞骨架肌动蛋白F-actin及黏附连接蛋白VE-cadherin在ECs中的分布和形态学改变;酶联免疫吸附实验(ELISA)检测ECs血管内皮生长因子(VEGF)分泌。结果: CREG过表达的ECs (EO组) 较EN组单层通透性明显增高 (P<0.05);CREG表达下调的ECs(ES组)较EN组单层通透性有所下降(P<0.05)。与EN组相比较,EO组细胞中F-actin排列紊乱,形成大量应力纤维; ES组F-actin则主要呈细丝状分布于细胞周边,中央分布较少。同时,EO组VE-cadherin在细胞周边的正常拉链状结构减少或缺失,细胞间隙增宽;而ES组VE-cadherin在细胞周边呈正常拉链状分布,细胞之间连接紧密。ELISA检测显示EO组细胞上清中VEGF分泌较EN组明显增加(P<0.05);ES组VEGF分泌较EN组减少(P<0.05)。应用VEGF中和抗体阻断后,CREG过表达引起的EO通透性增加的现象明显受到抑制。结论: CREG过表达可能通过VEGF介导的信号途径引起F-actin重构及VE-cadherin减少,使血管内皮细胞单层通透性增加。     

人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应因子

背景：外源性刺激引起血管屏障功能损伤的分子机制是血管病理生理学尚未阐明的热点问题之一。目的：探讨炎症递质脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞单层通透性改变的效应分子,寻找有效治疗靶点。方法：应用脂多糖刺激并观察人脐静脉内皮细胞骨架蛋白F-actin和细胞单层通透性的改变。应用荧光免疫组化和Westernblot方法检测脂多糖刺激前后细胞中RhoA和SRF等信号分子的改变。并通过阻断实验证实RhoA-SRF信号通路的作用。结果与结论：100μg/L脂多糖刺激6h可引起人脐静脉内皮细胞中F-actin快速重构并形成大量应力纤维,细胞单层通透性明显增强。细胞中活化RhoA的表达明显增加,SRF发生明显的入核转位现象。应用特异性分子抑制剂Y27632抑制RhoA的活化后,细胞中F-actin重构现象消失,细胞单层通透性增加也受到明显抑制,SRF蛋白发生明显的出现转位。而应用LatrunculinB抑制脂多糖刺激的人脐静脉内皮细胞中F-actin应力纤维形成,对抗通透性增加,但RhoA活化未受到干扰,SRF入核现象则受到抑制。提示RhoA-SRF通路的活化介导了脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞中F-actin重构和内皮单层通透性增加,特异性抑制F-actin也可以阻断脂多糖引起的血管内皮单层通透性增加,同时反馈抑制SRF的入核活化现象。     

纤维蛋白原与冠心病危险因素的相关性分析

目的　探讨血浆纤维蛋白原 (Fg)与冠心病危险因素的相关性 ,并比较其在不同冠心病类型及病变程度中的差异。方法　选择 2 0 0 2年 1～ 6月于我院心内科住院、因胸痛拟诊冠心病而接受冠状动脉造影的患者 6 6 4(男 4 77,女 187)例 ,应用Clauss凝固法测定其血浆Fg水平 ,并与其年龄、性别、血脂水平、有无高血压、糖尿病、吸烟、饮酒及冠心病类型、冠脉病变程度进行统计学分析。结果　年龄与Fg水平成正相关(r =0 .110 ,P =0 .0 14 ) ;血脂水平中各项指标与Fg水平相关性无统计学意义 ;冠心病患者中有高血压者Fg水平较无高血压者高 [(4 .3± 1.4 ) g/L和 (4 .0± 1.4 ) g/L ,P <0 .0 5 ],而Fg水平与性别、吸烟、饮酒、既往心梗史、糖尿病及冠心病家族史无统计学联系 (P >0 .0 5 ) ;多元逐步回归分析 ,年龄对回归方程贡献最大 ,标准回归系数为 0 .16 0 ,P =0 .0 10 ;高血压贡献次之 ,标准回归系数为 0 .14 0 ,P =0 .0 2 3。急性冠脉综合征(ACS)患者血浆Fg水平高于非冠心病者 [(4 .4± 1.4 ) g/L和 (4 .0± 1.8) g/L ,P <0 .0 5 ],同时亦高于稳定性心绞痛患者 (P <0 .0 5 )。 3支病变者血浆Fg水平高于单支病变者 [(4 .3± 1.4 )g/L和 (4 .0± 1.3) g/L ,P <0 .0 5 ]。结论　血浆Fg水平与患者年龄、高血压密切相     

低氧预刺激对大鼠骨髓源性内皮祖细胞生物学活性的影响

目的探讨低氧预刺激对内皮祖细胞(EPC)生物学活性的影响,以进一步提高EPC移植治疗的效能。方法2003-02~2004-02在沈阳军区总医院将体外分离培养大鼠骨髓来源的EPC,分别置于正常氧环境和低氧环境中培养,观察低氧对EPC增殖能力、移行能力、成血管能力的影响。结果低氧组EPC增殖活性增加,镜下每高倍视野(HP)贴壁细胞数明显多于对照组[(91·0±8·0)对(42·5±5·3),P<0·01]。低氧预刺激可增加EPC对血管内皮生长因子(VEGF)的趋化移行能力,移行细胞数明显多于对照组[(112·2±13·2/HP对(43·4±9·2)/HP,P<0·01],且最大移行距离较长[(542·0±42·7)μm对(282·0±28·6)μm,P<0·01]。低氧组体外成血管能力强于对照组,且其VEGF及胚胎肝激酶(Flk-1)的mRNA表达亦明显增高。结论低氧预刺激可多方面提高EPC生物学活性,包括增殖活性、移行能力及体外成血管功能,其改变与VEGF及Flk-1表达的增高呈一致性。     

大鼠血管平滑肌细胞迁移与西洛他唑的干预效应

目的:探讨西洛他唑对原代培养大鼠血管平滑肌细胞迁移能力的影响及其可能的调控作用。方法:实验于2003-03/12在解放军沈阳军区总医院全军心血管病研究所完成。使用胶原酶消化法处理健康雄性SD大鼠,获得原代培养的鼠血管平滑肌细胞,加入终浓度为0.5μmol/L西洛他唑培养72h为西洛他唑组,对照组为加入等量的Dulbecco改良的Eagle培养液培养的血管平滑肌细胞。应用细胞刮伤实验和基质金属蛋白酶活性测定分析西洛他唑对原代培养血管平滑肌细胞迁移能力的影响。应用蛋白质印记杂交方法分析给药前后血管平滑肌细胞内基质金属蛋白酶2,9和细胞外信号调节激酶蛋白的表达情况。结果:①细胞刮伤实验显示,与对照组比较,西洛他唑组血管平滑肌细胞迁移能力明显受抑,迁移距离明显缩短。明胶酶活性分析发现,西洛他唑组细胞基质金属蛋白酶活性明显低于对照组。②蛋白质印迹杂交分析发现,西洛他唑可引起原代培养血管平滑肌细胞迁移能力下降。西洛他唑组细胞内基质金属蛋白酶2,9蛋白表达明显低于对照组(14.34±0.70,12.65±0.98;93.67±1.90,83.67±1.05,t=67.86,85.65,P<0.05)。③蛋白质印迹杂交分析检测显示,西洛他唑组与对照组血管平滑肌细胞内信号调节激酶1,2蛋白表达无明显差异(P>0.05);细胞内磷酸化信号调节激酶蛋白表