M2抗体人源靶抗原三联体的克隆表达及其在原发性胆汁性肝硬化中的应用

目的 设计克隆表达抗原蛋白三联体BPO，利用纯化的重组BPO，建立原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)特异性免疫学诊断方法。方法 利用基因工程方法克隆表达M2抗原及其三联体BP0，并加以鉴定。纯化BPO，建立ELISA法。应用ELISA法检测17例PBC患血清M2抗体，以167例非PBC患和1225例健康人作对照。结果 17例临床诊断为PBC的患，M2抗体均为阳性，而对照组M2抗体均为阴性。结论 本法检测M2抗体有较好的敏感性及特异性，为PBC的临床诊断提供了有效手段。     

人外周血淋巴细胞和粒细胞褪黑素受体亚型mt1 的检测

目的 检测人外周血淋巴细胞和粒细胞的褪黑素受体(MR)亚型mt1和其细胞内定位。方法 分离出健康成年人外周血淋巴细胞和粒细胞，应用RT-PCR技术分别检测其亚型mt1的mRNA，阳性产物用自动测序仪测序；同时将所分离的淋巴细胞和粒细胞制成细胞涂片，应用免疫组化染色检测mt1在淋巴细胞和粒细胞上的分布。结果 RT-PCR产物电泳显示：人外周血淋巴细胞和粒细胞均存在mt1阳性条带，片段长度约370bp，测序结果显示扩增产物与GenBank的人mt1受体亚型的基因序列相吻合；免疫组化结果显示：人外周血淋巴细胞和粒细胞均存在mt1受体蛋白，分布于细胞膜、细胞浆和细胞核，以细胞膜和细胞浆为主。结论 人外周血淋巴细胞和粒细胞中均存在MR的亚型mt1,外周血淋巴细胞和粒细胞为褪黑素作用的外周靶器官，提示褪黑素在生理及病理情况下可能对免疫系统有调节作用。     

可溶性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体在强直性脊柱炎患者血清中的表达及临床意义

目的探讨肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体(sTRAIL)在强直性脊柱炎(AS)患者和健康个体血清中的表达及其临床意义。方法应用ELISA法检测60例AS患者和30例健康对照血清sTRAIL的浓度;应用ESR自动化分析仪和特定蛋白分析仪分别测定红细胞沉降率(ESR)和血浆C反应蛋白(CRP);分析HLA-B27阳性和阴性的AS患者血清sTRAIL水平与ESR、CRP的相关性。结果AS患者血清sTRAIL浓度明显高于对照组(P<0.01),且HLA-B27阳性和阴性AS患者均明显高于对照组(P<0.01),但两者比较,差异无统计学意义(P>0.05)。在HLA-B27阳性AS患者中,血清sTRAIL水平与CRP呈明显的相关性而与ESR的相关性并不明显;而HLA-B27阴性AS患者血清sTRAIL与ESR及CRP均无显著相关性。结论血清sTRAIL水平在AS中明显上调,与HLA-B27阳性与否无显著相关性。AS患者血清sTRAIL与ESR无相关性,而与CRP是否具有显著相关性受到HLA-B27阳性与否的影响。总之,血清sTRAIL水平的改变可能与AS的发生和发展密切相关。     

用重组M2三联体抗原建立原发性胆汁性肝硬化免疫检测法

目的 建立原发性胆汁性肝硬化（PBC）特异性免疫学检测方法。方法 在重组质粒表达的基础上，用亲和层析进一步纯化重组蛋白后，用酶免疫吸附法检测M2抗体。结果 在PBC组11例患者哈部检出M2抗体，阳性率为1005，而非PBC组75例患者中无一检出M2抗体，本法与病理检查和临床诊断的相关性有非常显著意义（P＜0.01）。结论 本法检测M2抗体有较好的敏感性及特异性，为PBC的早期发现和临床诊断提供了有力的工具。     

定量RT-PCR检测PBC患者外周血中颗粒溶素的基因表达水平

目的建立检测人颗粒溶素(granulysin,GNLY)mRNA含量的实时荧光定量RT-PCR的方法,并测定PBC患者外周血单个核细胞(PBMC)中GNLY的基因表达水平,探讨GNLY基因表达水平与原发性胆汁性肝硬化(PBC,primarybiliary cirrhosis)发生发展的关系。方法基于TaqMan荧光探针技术,构建质粒pET28a-GNLY,作为定量模板,建立实时荧光定量RT-PCR方法。用此方法测定了60例PBC、60例乙型肝炎肝硬化及60例健康对照者外周血中GNLY mRNA的含量。结果PBC患者GNLY mRNA的表达范围为5.35×107-4.61×109拷贝/μg RNA;健康对照者为9.28×105-7.32×107拷贝/μg RNA。PBC组GNLY mRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组(P<0.01)和疾病对照乙型肝炎肝硬化组(P<0.001)。结论成功建立了人GNLY基因表达含量的荧光定量检测方法,PBC患者GNLY mRNA的含量显著高于健康对照组,GNLY表达与PBC的发生发展存在一定的关联性。     

自身免疫性肝病患者血清转化生长因子β_1测定的临床意义

目的　探讨血清中转化生长因子 β1(TGF β1)含量变化对自身免疫性肝病的临床意义。方法　采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验 (ELISA)检测 15 0名健康人、76例乙型肝炎患者、2 88例自身免疫性肝病患者 [分为自身免疫性肝炎 (AIH)组、原发性胆汁性肝硬化 (PBC)组及未明原因肝损组 ]血清TGF β1水平。结果　乙型肝炎组患者血清TGF β1水平较正常组显著升高 (P <0 .0 5 ) ;而自身免疫性肝病患者血清中TGF β1水平均显著低于正常对照组 (P <0 .0 5 )。结论　自身免疫性肝病患者血清中TGF β1水平降低与发病有一定的联系。     

基于“中国知网”的原发性胆汁性肝硬化文献计量学研究

目的分析我国原发性胆汁性肝硬化相关文献的研究状况及发展趋势,为本领域研究人员提供参考。方法以"中国知网"数据库为数据来源,利用文献计量学的方法对国内期刊刊发的原发性胆汁性肝硬化有关文献进行统计分析,从发表时间、发文地区、发文单位、作者发文量、作者合作情况、基金资助、发文期刊和文献被引用几个方面进行统计,初步分析本研究领域的状况。结果截至2016年7月31日,检索到文献1 910篇,得到有效相关文献1 549篇。发文量从2001开始增长迅速;发文以北京、上海、江苏和广东为主;发文10篇及以上的单位共有17家,最多达111篇;作者发文数量最多达15篇,66.37%的作者只有1篇;不同作者之间"合作度"和"合著率"分别为3.52%和79.79%,其中"同单位合著"达59.13%;刊文量前10的期刊发文总量仅占4.45%;受到各级基金资助的文献占21.43%;文献被引频次偏低,零引用文献达34.28%。结论原发性胆汁性肝硬化的科研工作近来有了很大进展,尚需更多关注与重视,增大基金支持力度,加强作者之间的合作和研究深度,在确保文献数量的同时提高文献质量。     

原发性胆汁性肝硬化模型中淋巴细胞增殖及活化诱导凋亡机制研究

目的 通过检测原发性胆汁性肝硬化(PBC)动物模型肝脏和脾脏淋巴细胞增殖及活化诱导凋亡(AICD),了解PBC模型小鼠的免疫耐受情况.方法 聚肌苷酸胞嘧啶核苷酸(polyI:C)5 mg/kg剂量注射C57BL/6小鼠建立PBC模型,分离肝、脾淋巴细胞并纯化CD4~+T淋巴细胞,然后以M2蛋白及刀豆蛋白A(ConA)结合抗-CD3刺激细胞增殖及AICD,定量PCR和免疫印迹技术检测凋亡相关基因及信号蛋白.结果 ①M2蛋白刺激后,空白对照组和PBS组的细胞增殖能力(分别为0.1988±0.0111和0.2068±0.0115)差异无统计学意义(P>0.05),但是PBC组小鼠细胞增殖能力(0.358±0.022)与以上两组相比显著增强,且PBC组小鼠肝内淋巴细胞增殖能力强于脾淋巴细胞(P<0.01).②空白对照组和PBS组之间AICD情况差异无统计学意义(74.70%±4.58%比74.20%±4.44%,P>0.05),但均显著高于PBC组(44.85%±6.47%,P<0.01),同时PBC组小鼠肝内CD4~+T细胞的凋亡率显著低于脾脏(P<0.01).③PBC组小鼠肝脾淋巴细胞FasL、TRAIL基因的表达较PBS组均明显降低(P<0.01),而Fas表达无明显改变.④PBC组小鼠CD4~+T细胞长构型Fas相关死亡区域样白细胞介素-1β转化酶抑制蛋白(FLIP_L)表达明显升高,且肝内T细胞表达较脾脏显著增加(P<0.01).结论 FLIP_L表达增高可能是AICD受到抑制的重要原因,同时FasL和TRAIL mRNA表达降低可能也起到一定的作用.     

TLR3途径诱导多发性骨髓瘤细胞株增殖抑制和凋亡机制研究

目的 研究聚肌苷酸胞苷酸( polyI:C)激活的TLR3通路对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞的增殖抑制和凋亡相关的生物学作用及相关机制.方法 RPMI8226细胞培养于RPMI 1640培养基,以不同浓度的polyI:C与该细胞作用不同的时间.收集细胞后,分别利用CCK-8和流式细胞术分析其增殖抑制和凋亡情况,同时抽提总RNA,相对定量PCR测定TLR3通路相关基因表达.结果 PolyI:C对RPMI8226的增殖抑制效应随着作用剂量的增加和时间的延长而增加,24h:12.30％±2.04％、22.50％±2.20％、37.90％±1.30％;48h:17.80％±1.52％、29.60±0.85％、45.80％±1.68％;72 h:25.10％±1.01％、34.60％±1.27％、60.50％±2.08％,差异有统计学意义(P＜0.05).浓度为50、100、200μg/ml的polyl:C与RPMI8226作用48 h后,细胞凋亡率分别为5.60％±1.06％、8.71％±1.06％、13.93％±1.17％,差异具有统计学意义(P＜0.05),而且随着polyI:C作用浓度增加,RPMI8226细胞中TLR3和TRIF mRNA相对于内参β-actin的表达均显著增高,TLR3:1.41±0.10、2.24±0.16、4.08±0.13;TRIF:1.07±0.16、1.97±0.13、3.56±0.19,各组间差异具有统计学意义(P＜0.05).结论 TLR3途径可以有效地抑制多发性骨髓瘤细胞增殖,并且诱导其凋亡,对多发性骨髓瘤的生物治疗具有潜在应用价值.     

热灭活白念珠菌刺激PBMC对颗粒溶素和TNF-α表达的影响

目的:研究热灭活白念珠菌刺激健康个体外周血单个核细胞对颗粒溶素和TNF-α表达的影响。方法:在热灭活白念珠菌刺激的情况下,采用ELISA和RT-PCR检测颗粒溶素的表达;采用SrCl2以及siRNA下调PBMC内颗粒溶素的表达,或者加入外源性颗粒溶素,观察TNF-α在mRNA和蛋白水平表达的变化。结果:热灭活白念珠菌刺激可以诱导PBMC合成颗粒溶素和TNF-α,采用SrCl2或siRNA下调颗粒溶素的表达均会引起TNF-α在mRNA和蛋白水平表达的下调,而加入外源性的颗粒溶素可以促进TNF-α的表达。结论:热灭活白念珠菌刺激PBMC可以引起颗粒溶素和TNF-α的表达,且颗粒溶素可能是促进TNF-α表达的因素。