Experimental study on ex vivo retrovirus-mediated aFGF gene transfer therapy in traumatic brain injury

Objective: To explore the effects of ex vivo retrovirus-mediated gene transfer therapy with acidic fibroblast growth factor (aFGF) in the management of traumatic brain injury. Methods: PLXSN-SPaFGF, a recombinant retroviral vector expressing biologically active aFGF was constructed and transfected into cultured embryonic astroglial cells which were injected into the surrounding areas of the contusion in the rat left parietal cortex. From 3 d to 1 month after the implantation, the survival of and aFGF gene expression in the implanted astroglial cells were examined, and neuronal apoptosis and rat motor function impairment evaluated. Results: The implanted aFGF-transduced astroglial cells survived and expressed aFGF mRNA and protein evidently at 3 d after grafting. The number of and aFGF gene expression in the astroglial cells increased remarkebly 7 d and decreased to some extent 1 month after the implantation. There were significant aFGF mRNA and protein expression in the neurons surrounding the contusion at 7 d that decreased to relatively low levels 1 month after the implantation of aFGF-transdued astrocytes. Diminished neuronal apoptosis (P＜0.05) and significantly improved in the previously impaired motor function (P＜0.05) of the rats were observed from 7 d to 1 month after the implantation. Conclusion: This experiment successfully conducted ex vivo aFGF gene transfer therapy in traumatic brain injury which proved to be effective in rescuing injured nerve cell from death and enhancing recovery of neurological deficiency.     

结核分枝杆菌对左氧氟沙星与莫西沙星的交叉耐药性及gyrA和gyrB基因突变分析

目的研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)对左氧氟沙星(levofloxacin,LVF)与莫西沙星(moxifloxacin,MXF)的交叉耐药性,分析gyrA和gyrB基因突变位点分布及突变位点与耐药水平的关系。方法采用改良罗氏培养基检测MTB标准菌株H37Rv、66株LVF耐药和55株LVF敏感的MTB临床分离菌株LVF和MXF的最低抑菌浓度(minimal inhibition concentra-tion,MIC)。通过PCR直接测序法测定gyrA和gyrB耐药基因片段。结果 MXF的MIC比LVF低2~4倍,MXF抗MTB菌株的活性是LVF的2~4倍。MTB标准菌株H37Rv未见gyrA和gyrB基因突变。66株LVF耐药和55株LVF敏感菌株均存在gyrA AGC95ACC(Ser→Thr)突变;55株LVF敏感菌株gyrA和gyrB基因未见其他突变。66株LVF耐药菌株中,40株(60.6%)gyrAGAC94(AAC或GGC或GCC或CAC或TAC)(Asp→Asn或Gly或Ala或His或Tyr)突变;19株(28.8%)gyrA GCG90GTG(Ala→Val)和1株(1.5%)gyrA GCG90AAG(Ala→Lys)(未见报导)双碱基突变;3株(4.6%)gyrA TCG91CCG(Ser→Pro)突变;1株(1.5%)gyrB GAC500AAC(Asp→Asn)突变;2株(3.0%)呈gyrA GAC94(AAC或GCC)(Asp→Asn或Ala)与gyrB GGG551AGG(Gly→Arg)(未见报导)双位点突变。gyrA GAC94(AAC或GGC)(Asp→Asn或Gly)突变引起FQs药物较高水平耐药;GAC94GCC(Asp→Ala)和GCG90GTG(Ala→Val)突变引起FQs药物较低水平耐药。结论 LVF与MXF之间存在交叉耐药,MXF MIC随LVF MIC增高而增高,但耐药水平不同。GyrA基因突变位点可能与耐药水平有关,有可能根据基因突变的位点分析耐药水平。     

人颗粒裂解肽突变子在大肠埃希菌中的构建与表达研究

目的构建NKG5突变基凶的原核表达载体并进行表达研究。方法采用寡核苷酸合成的方法,拼接成为NKG5-Set的编码序列．克隆到pGEMT载体上,测序正确后,再切下编码序列连接到质粒pGEX-4T—1中,重组表达载体转化大肠埃希菌BL21（DE3）plysS,用IPTG诱导使融合蛋白高效表达。结果成功获得重组表达载体pGEX-4T-1-NKG5-Ser,转染大肠埃希菌BL21（DE3）pLysS,诱导表达后,SDS—PAGE和免疫印迹反应均显示显示出相对分子量（Mr）为35kD的蛋白条带,证明融合蛋白表达成功。结论获得了突变NKG5与GST的融合蛋白,为进-步的工作打下了基础。     

在BEP2D细胞恶性转化过程中TGF-β1对Smad7表达的调节

背景与目的:细胞逃避转化生长因子-β(TGF-β)诱导的对细胞生长、增殖的抑制是许多肿瘤发生的一个重要机制.Smad7是TGF-β信号转导通路的抑制型Smads,它可阻断TGF-β信号在胞浆内的传导,其紊乱是TGF-β信号转导通路紊乱的机制之一.本研究旨在分析在细胞恶性转化过程中,Smad7基因表达是否发生紊乱,TGF-β1对Smad7基因的调控功能有无发生变化,以探索细胞发生恶性转化的原因.方法:培养BEP2D细胞及BERP35T-2细胞,于收获前60min和90min加入不同剂量的TGF-β1,提取细胞总RNA,分别以未加TGF-β1的细胞组作为对照,用Northernblot杂交比较两组细胞Smad7mRNA表达的差异以及细胞对TGF-β1细胞因子刺激的反应性.同时提取BEP2D及BERP35T-2细胞蛋白,用Westernblot方法比较两组细胞内源性TGF-β1表达的差异.结果:Smad7mRNA表达水平恶性转化细胞高于永生化细胞;加了TGF-β1细胞因子后,BEP2D细胞Smad7mRNA表达增高,BERP35T-2细胞表达水平改变不明显.而内源性TGF-β1的表达水平,BERP35T-2细胞稍高于BEP2D细胞.结论:Smad7在辐射致肺癌细胞系中的过表达及对TGF-β1应答的降低可能是辐射诱发肺癌发生的机制之一.     

RESPONSIVENESS OF Smad7 GENE TO TGF-b1 IN THE TUMORIGENESIS

Transforming growth factor-b (TGF-b) is a potent natural antiproliferative agent that plays an important role in suppressing tumorigenicity. Disruption of TGF-b signaling is implicated in numerous cancers, such as colon-rectal cancer, pancreatic cancer, lung cancer, skin cancer, et al. TGF-b signaling occurs via ligand-initiated complex formation of a heteromeric serine-threonine kinase receptor complex, following which the TGF-b type I receptor is phosphorylated by the constitutively act…     

Rv1196基因克隆及其在大肠杆菌中的高效表达

目的 用PCR方法从结核菌基因组中扩增Rv1196基因,将之重组到pET24b载体,在大肠杆菌中进行融合表达,重组蛋白纯化后通过免疫印迹反应初步鉴定其抗原性和特异性.方法 提取H37Rv标准株的基因组DNA;设计Rv1196基因两端的引物,通过PCR方法从基因组DNA中扩增出Rv1196抗原的基因,直接连接到pGEMT载体上,经过筛选鉴定后,将重组子测序;将测序的质粒用NdeI和XhoI双酶切后连接到pET24b载体上,筛选得到重组载体pET24b-39;转化BL21并优化表达条件,采用金属鏊合层析纯化重组蛋白;选取7例结核病阳性临床血清标本和7例健康人血清标本进行Western blot分析.结果 获得了氨基酸编码序列正确的基因,与数据库中报道一致;Rv1196基因能够在大肠杆菌中高效表达,其表达量约占细菌总蛋白的30%以上;重组抗原不与健康人血清反应,但与结核标本血清呈强烈反应.结论 重组Rv1196抗原具有较好的特异性和抗原性,有较好的血清学分析价值.     

亚细胞定位及信号转导检测技术在hrnt_1基因功能研究中的应用

目的 :hrnt_1是本实验室克隆的全长基因 ,GenBankNr库中编号为AF2 2 3393。实验证实该基因与支气管上皮细胞恶性转化相关 ,但具体的生物学功能尚不清楚。本研究旨在建立一种功能研究的方法 ,为探索hrnt_1在细胞恶性转化过程中的生物学功能提供线索。方法 :构建hrnt_1与pEGFP荧光素表达载体 ,通过融合蛋白的表达 ,观察hrnt_1基因产物在细胞中的位置分布 ;利用信号通路检测技术 ,观测hrnt_1对细胞内信号转导通路的影响。结果 :hrnt_1产物主要分布在细胞核中 ,对Myc Max,GR ,NFκB ,EIK_1 STAT等核转录因子活性有上调作用。结论 :细胞定位与信号通路检测技术相结合的方法简便、快速 ,适用于新的疾病基因功能研究。     

Rv2653c在大肠埃希菌中的克隆与表达研究

目的从H37Rv标准株克隆出结核菌Rv2653c基因并进行表达与初步分析。方法根据H37Rv基因组序列合成引物,以PCR方法钓取Rv2653c基因,克隆到pGEM-T上,挑取阳性克隆进行测序,将正确编码基因克隆到pET24b载体上,在BL21大肠埃希菌菌株中以IPTG诱导表达重组蛋白。以金属螯合层析初步分离纯化重组蛋白,采用western blot方法对重组抗原进行抗原性初步分析。结果首先获得了重组的Rv2653c编码的蛋白,表达产率不低于20%,初步纯化纯度约90%,以人血清进行的western blot分析发现,Rv2653c重组蛋白有较好的抗原性。结论获得了Rv2653c重组蛋白为进一步寻探讨其功能及应用价值奠定基础。     

一种热稳定人成纤维细胞生长因子突变体原核表达及活性鉴定

目的原核系统可溶性地表达一种热稳定性的人角质细胞生长因子-2（human keratinocyte growth factor-2,hKGF-2）并鉴定其生物活性。方法通过重叠PCR方法进行定点突变,从人胎肝cDNA文库中获得编码人KGF-2突变体的核酸序列并克隆至原核表达载体pBV220进行诱导、表达和纯化。分别检测重组KGF-2及其突变体重组蛋白的生物活性和室温条件下的稳定性。结果 KGF-2及其突变体具有相同的促Hep-2细胞的增殖能力。室温状态下48 h内,rhKGF-2出现明显降解现象而rhKGF-2突变体几乎没有出现降解,表现出强的热稳定性。结论 KGF-2突变体具有天然KGF-2的生物活性,但其热稳定性明显优于天然KGF-2蛋白,为进一步研究KGF-2的结构和功能奠定了一定的基础。     

结核分枝杆菌16KD重组蛋白的纯化及血清学诊断应用价值的研究

目的：纯化获得结核分枝杆菌重组16KD蛋白，并评价其在血清学诊断方面的应用价值。方法：应用亲和层析方法纯化结核分枝杆菌重组16KD蛋白，应用ELISA方法检测220例血清中的抗结核抗体。结果：结核分枝杆菌重组16KD蛋白以包涵体形式表达，以48名正常人血清0D492＋2S为正常限值，57例PPD阳性血清，47例菌阳结核患者血清和68例菌阴结核患者血清阳性检出率分别为19．30％、93．62％和82．35％。结论：结核分枝杆菌16KD重组蛋白以包涵体形式高效表达，具有较强的抗原特异性和免疫反应性。