异烟肼、利福平治疗肺结核致肝毒性易感基因的研究

目的：探讨N-乙酰基转移酶(NAT2)基因型与异烟肼、利福平治疗肺结核致肝毒性的相关性。方法：通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR—RFLP)技术分析67例经利福平、异烟肼治疗后发生或未发生肝功能异常的肺结核患者NAT2基因多态性的部位、性质及发生率。结果：病例组和对照组857位密码子多态性分别是20．3％和7．1％，两组差异显著。结论：NAT2基因型与异烟肼和利福平所致肝毒性关系密切，其中857位密码子点突变可能是结核患者发生肝毒性的易感基因型之一。     

结核分支杆菌Ag85B蛋白在大肠杆菌中的高效表达

目的：通过结核分支杆菌Ag85B基因在大肠杆菌中的表达，获得大量纯化的重组Ag85B(rAg85B)蛋白。方法:应用PCR技术扩增结核分支杆菌H37RvAg85B DNA序列；以质粒pET24b为表达载体，构建Ag85B重组质粒，然后转化大肠杆菌BL21(DE3)；以IPTG诱导转化子，通过SDS—PAGE电泳鉴定rAg85B的表达水平，采用Novagen公司生产的His．Bind蛋白纯化试剂盒纯化rAg85B蛋白。结果:重组质粒PET24b—Ag85B测序表明与报道的序列相同；它在大肠杆菌BL21(DE3)细胞内以包涵体形式存在，表达量占菌体总蛋白的30％左右。纯化后的rAg85B样品经SDS—PAGE和光密度扫描分析表明其纯度约为95％左右，每100ml培养菌可获得10mg左右纯化的重组蛋白。结论:pET24b—Ag85B大肠杆菌工程菌株能高效表达rAg85B蛋白，大量纯化的rAg85B为其进一步的研究与应用奠定了基础。     

结核分枝杆菌保护性抗原的研究进展

结核分枝杆菌（MTB）蛋白根据蛋白分布的位置可分为分泌蛋白、胞质蛋白和膜蛋白。分泌蛋白是MTB在早、中期分泌释放于菌体外的一组蛋白，游离于培养基中或在感染细胞的吞噬小体内，在菌体内仅有微量存在；而胞质蛋白主要存在于细菌的细胞质中，在细菌对数生长的晚期细菌死亡后才释放到培养基中。将培养不超过5d的滤液蛋白称为短期培养滤液蛋白，这是记忆性免疫CD4^＋T淋巴细胞的靶分子；将培养7d以上的滤液蛋白称为长期培养滤液蛋白，随着培养时间的延长，滤液中蛋白越来越多，由于部分MTB开始裂解死亡，释放胞质蛋白，培养42d时滤液中已有100多种蛋白质。结核病保护性免疫主要是细胞免疫，诱导细胞免疫反应的抗原主要存在于细胞壁、细胞质和培养滤液中，其中分泌蛋白和细胞壁表面的蛋白是主要的免疫保护性抗原，将成为新疫苗研究的首选靶抗原。现将保护性抗原的编码基因、生物学特性、免疫学功能等介绍如下。     

人型结核杆菌克隆DNA探针的制备及其应用的研究

用限制性内切酶ＰｓｔⅠ消化人型结核杆菌Ｈ３７ＲｖＤＮＡ,与质粒ｐＵＣ１９ ＤＮＡ连接后转化大肠杆菌,经同位素３２Ｐ标记的人型结核杆菌Ｈ３７Ｒｖ全染色体ＤＮＡ探针筛选出６个阳性克隆（ＭＴ１￣６）,其中克隆ＤＮＡ片段ＭＴ２（４．２Ｋｂ）、ＭＴ４（３．５Ｋｂ）和ＭＴ５（３．０Ｋｂ）标记成探针,检测了２２种分支杆菌标准株和１５侏人型结核杆菌临床分离侏以及２种非分支杆菌,其杂交结果完全相同,与人型结核杆菌及     

复合PCR-膜芯片技术对结核分枝杆菌链霉素耐药性的快速检测

目的　应用复合聚合酶链反应 (复合 PCR) -膜芯片技术快速检测结核分枝杆菌对链霉素 ( SM)的耐药性。方法　设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐 SM基因 rps L和 rrs的寡核苷酸探针制作膜芯片 ,与结核分枝杆菌分离株生物素标记的 rps L和 rrs基因复合 PCR产物进行反向斑点杂交 ,并与 PCR-单链构象多态性 ( PCR- SSCP)和 PCR-直接测序 ( PCR- DS)结果比较。结果　 5 2株结核分枝杆菌临床分离株中 ,9株敏感株rps L和 rrs基因的 SSCP图谱、膜芯片杂交结果与标准株完全相同 ;4 3株耐 SM菌株中 ,33株存在 rps L 基因4 3位密码子 AAG→ AGG突变 ,5株有 rrs基因 5 13位 A→C突变 ,1株有 rrs基因 5 13位 A→ T突变 ,突变率为 90 .7%。结论　膜芯片技术检测结核分枝杆菌耐 SM基因型灵敏度高、特异性强、简便、快速 ,可用于临床耐药性检测     

结核病临床分离株及痰标本中embB基因型的快速测定

目的建立快速测定结核病耐乙胺丁醇(EMB)分离株和痰标本中结核分枝杆菌EMB耐药基因型的方法，以期为患者提供及时、有效地化验结果。方法应用16S rDNA聚合酶链反应(PCR)-单链构象多态性(SSCP)和PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)对11株耐EMB分离株和46例结核病痰标本进行分子菌种鉴定和embB基因突变的部位与性质分析。结果以结核分枝杆菌H37Rv标准株为对照，11株耐EMB分离株和46例临床痰标本经16S rDNA PCR-SSCP分析电泳图谱均与结核分枝杆菌标准株相同；限制性内切酶NlaⅢ消化embB基因扩增产物显示，11株耐EMB分离株中4株(36．4％)不被NlaⅡ消化；46例结核病痰标本中10例(21．7％)不被NlaⅡ消化。结论部分结核分枝杆菌耐EMB是由于embB基因突变所致。采用PCR-SSCP和PCR-RFLP方法可直接快速测定结核病耐EMB分离株和痰标本中结核分枝杆菌耐EMB基因型。     

应用PCR-反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌耐链霉素基因型

目的 应用膜反向斑点杂交技术快速检测结核分枝杆菌对链霉素(SM)的耐药性。方法 设计与合成用于检测结核分枝杆菌耐SM基因rpsL和ms的寡核苷酸探针，点于硝酸纤维素膜上，与结核分枝杆菌分离株生物素标记的聚合酶链反应(PCR)产物进行反向斑点杂交，并与PCR-单链构象多态性(PCR—SSCP)和PCR-直接测序(PCR-DS)结果比较。结果 53株结核分枝杆菌临床分离株中，三种检测方法符合率为100％。9株敏感株rpsL和ms基因的SSCP图谱、膜杂交结果与标准株完全相同；44株耐SM菌株中，33株存在rpsL基因43位密码子AAG→AGG突变，6株有ms基因513位A→C突变，1株有ms基因513住A→T突变，突变检出率为90．9％，40株耐SM菌株和9株敏感株可用膜杂交方法检测出来，与传统药敏试验方法检测符合率为49／53。结论 应用膜反向斑点杂交技术检测结核分枝杆菌耐SM基因型灵敏度高、特异性好、简便、快速，可用于临床耐药性检测。     

分枝杆菌菌种鉴定DNA微阵列的初步研究与应用

目的制备快速鉴定分枝杆菌菌种的DNA微阵列。方法根据19种分枝杆菌标准株的16SRNA序列设计寡核苷酸探针,制备DNA微阵列,通过反向杂交技术鉴定19种分枝杆菌标准株、9种非分枝杆菌标准株和31株分枝杆菌临床分离株带荧光标记的PCR产物。结果该DNA微阵列与9种非分枝杆菌标准株不杂交,具有分枝杆菌特异性;可将19种分枝杆菌标准株鉴定到群或种,具有较高的分枝杆菌种特异性。应用PCR-SSCP分枝杆菌初步菌种鉴定方法对31株分枝杆菌临床分离株进行初步的鉴定,9株为结核分枝杆菌复合群和22株为非结核分枝杆菌。应用DNA微阵列进一步进行菌种鉴定,9株与探针a杂交阳性,为结核分枝杆菌复合群;2株与探针c杂交阳性,为胞内分枝杆菌;8株与探针d杂交阳性,为堪萨斯分枝杆菌或瘰疬分枝杆菌或猿猴分枝杆菌或胃分枝杆菌;1株与探针k杂交阳性,为戈登分枝杆菌;2株与探针p杂交阳性,为龟分枝杆菌脓肿亚种;2株与探针r杂交阳性,为偶然分枝杆菌;1株与探针s杂交阳性,为草分枝杆菌;2株与探针a和p杂交阳性,为结核分枝杆菌和龟分枝杆菌脓肿亚种复合感染株;1株与探针a和r杂交阳性,为结核分枝杆菌和偶然分枝杆菌复合感染株;3株与该芯片杂交阴性。2株临床分离株经基因测序也证实DNA微阵列鉴定的特异性。结论该DNA微阵列有可能简便、快速、准确地     

用耐药基因检测方法指导老年肺结核病人治疗的临床研究

目的：了解老年肺结核病人的结核分支杆菌耐药情况，评价它们的临床应用价值。方法：采用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCR－SSCP）检测结核分支杆菌rpoB,katG,rpsL,pncA,embB基因突变和药物敏感试验（比例法），了解117例老年结核病人结核分枝杆菌耐药情况。探讨和比较2种耐药性检测方法的检测效果。结果：1／2上的肺结核病人至少耐2种抗结核药物，对RFP、INH、SM、PZA和EB总耐药率为82．1％、71．7％、63．2％、51．2％和35．0％，耐多药率为67．5％，rpoB,katG,rpsL,PpncA和embB基因突变率分别为72．8％、64．9％、59．8％、41．0％和30．7％，多基因突变株达76．0％，结核杆菌耐药基因突变与耐药水平联系密切，多数结核分支杆菌耐药基因突变易发生在高耐药区，也有少数基因突变发生在低耐药区。根据药敏试验和耐药基因检测，耐多药结核病人6个月治愈率分别达到54．8％和62．8％，治疗效果满意，两种方法没有显著性差异（P＞0．05）。结论：耐药基因检测指寻治疗是一种新探索，PCR－SSCP方法敏感，特异，可以快速检测结核菌rpoB,katG,rpsL,pncA和embB耐药基因突变，可能会成为临床指导用药的好方法。     

Ag85b-卡介苗重组疫苗的构建及鉴定

目的构建结核分枝杆菌Ag85b-卡介苗重组疫苗,研究其免疫原性及抗结核作用,以期获得结核病预防性和治疗性疫苗。方法通过基因工程重组技术将结核分枝杆菌保护性抗原Ag85b的编码基因与穿梭质粒载体pYUB295重组,通过电穿孔技术导入卡介苗中,应用PCR扩增、PAGE电泳鉴定重组卡介苗。结果通过PCR扩增获得Ag85b基因,与穿梭表达载体pYUB295重组后,通过PCR扩增、限制性内切酶酶切、DNA测序鉴定表明成功地构建了Ag85b基因pYU295重组质粒。将重组质粒通过电穿孔导入卡介苗,重组卡介苗在抗性培养基上生长良好。pYUB295-Ag85b重组卡介苗基因组DNA的PCR扩增以及培养上清液的PAGE电泳表明：Ag85b-卡介苗重组疫苗构建正确,Ag85b蛋白在卡介苗中分泌表达。结论成功构建了Ag85b-卡介苗重组疫苗。