移植人羊膜细胞对大鼠创伤性脑损伤的实验研究

目的 探究大鼠TBI后脑内移植人羊膜细胞（HACs）对大鼠运动功能的影响。方法 HACs经分离、Hoechst33342标记后重悬调整细胞浓度为10^5/μl；采用改进的Feeney自由落体法打击大鼠脑皮层后肢运动区域，损伤后24h经微量注射器和立体定向仪将Hoechst33342标记的HACs 10μl分别移植于挫伤灶中心和挫伤灶边缘；在TBI后的28d内采用钉板平衡木行走测试大鼠运动功能变化，运动功能检测结束后取出脑组织行组织学检测。结果 治疗组滑落脚步数明显少于对照组（P〈0．05）；移植的HACs呈蓝色荧光；部分移植HACs可见MAP-2阳性表达。结论 移植HACs使大鼠TBI后运动功能明显改善。     

超顺磁性氧化铁标记神经干细胞移植入局灶性脑缺血大鼠纹状体的MRI示踪及其对学习记忆的影响

目的 探讨以超顺磁性氧化铁（SPIO）标记的胎鼠神经干细胞（NSCs）移植入局灶性脑缺血大鼠纹状体的MRI示踪及其对学习与记忆的影响。方法 体外培养的胎鼠NSCs用Fe2O3-多聚左旋赖氨酸（Fe2O3-PLL）标记，普鲁士蓝和台盼蓝染色分别检测标记率和细胞活力。将大鼠随机分为A组（正常对照组）、B组（正常标记NSCs移植组）、C组（脑缺血组）、D组（标记NSCs移植组）、E组（未标记NSCs移植组）及F组（灭活标记NSCs移植组）。取C组、D组、E组和F组大鼠制备局灶性脑缺血模型；将标记及未标记的NSCs悬液及灭活的标记NSCs悬液分别定向注射于B组、D组、E组和F组大鼠左侧纹状体内；移植后3d、7d、2周、3周、4周，对A组、C组、D组和E组分别进行Y型电迷宫检测；对B组、D组和F组进行活体MRI示踪扫描；MRI扫描后的大鼠行脑组织切片普鲁士蓝染色，观察移植的NSCs分布。结果NSCs的FeO3-PLL标记率近100％，标记的NSCs细胞活力为95％。与C组比较，D组和E组移植后各时间点大鼠的学习与记忆能力明显改善（均P〈0.05）；MRI显示移植4周后D组移植区低信号影范围较大；脑组织切片可见移植的NSCs沿胼胝体向对侧迁移。结论 Fe2O3-PLL标记不影响NSCs活力；移植NSCs能改善脑缺血大鼠的学习与记忆功能；移植的NSCs可向病灶区迁移。     

神经干细胞移植对大鼠视神经损伤后节细胞的保护作用

目的探讨神经干细胞（NSCs）移植对视神经受损SD大鼠视网膜节细胞（RGCs）的保护作用。方法将48只健康成年SD大鼠随机分为N组（NSCs移植组）和C组（对照组），均使用精确校准方法在右眼造成部分视神经损伤，左眼作为正常对照。从胚胎SD大鼠海马分离NSCs。利用细胞培养和体内移植技术。将培养后的NSCs注入N组大鼠右眼玻璃体内，C组大鼠右眼玻璃体内注入同等体积的PBS。处死前3d在双上丘注射3％快蓝逆行标记双眼RGCs。将大鼠分别于注射NSCs或PBS后7d、14d、21d、28d处死，各分为4组。每组6只。分离视网膜置于荧光显微镜下，摄影输入计算机图像分析仪计数RGC。计算RGC标识率。另取6只健康成年SD大鼠作NSCs移植，分别于移植后7d、28d处死，每时间段3只。通过视网膜免疫荧光切片观察NSCs在视网膜的存活、整合情况。结果N组大鼠各时间段RGCs标识率与C组同时间段比较均增高，有显著性差异（P〈0．01）；N组与C组RGCs标识率均随时间延长而降低。且前后段时间比较有显著性差异，但N组降低速度明显慢于C组。NSCs移植7d后部分移植细胞迁移进入视网膜的内网层和节细胞层。28d后可见移植细胞广泛整合至宿主视网膜内。结论NSCs移植入视神经损伤大鼠视网膜后可提高视网膜神经节细胞的存活率．对受损的节细胞具有一定的保护作用。     

三氧化二砷诱导C6胶质瘤细胞凋亡实验研究

目的：研究三氧化二砷（As2O3）在体外是否具有抗鼠胶质瘤作用,并对其作用机制进行初步探讨。方法：应用不同浓度As2O3,且在不同时间点分别处理C6胶质瘤细胞株及原代培养的正常鼠神经胶质细胞,采用甲基噻唑基四唑（MTT）法,观察As2O3对C6胶质瘤细胞株及正常鼠神经胶质细胞生长的影响,以透射电镜、Hoechst33342和碘化丙啶（PI）双重荧光染色检测两种细胞凋亡的形态变化,并用异硫氰酸荧光素（FITC）标记的Annexin-V和PI双标记法通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。结果：MTT法发现,As2O30.5～8.0μmol/L的浓度均可显著抑制C6胶质瘤细胞株的生长,而对正常原代神经胶质细胞株的抑制作用较弱。经As2O3作用后,透射电镜、Hoechst33342/PI双染荧光均观察到C6胶质瘤细胞发生了显著的凋亡形态改变;运用Annexin-V-FITC/PI双标记法在流式细胞仪检测显示,随As2O3浓度的增大和时间的延长,C6胶质瘤细胞株的凋亡率明显上升,而正常神经胶质细胞的凋亡率要明显小于C6胶质瘤细胞株。结论：As2O3在体外可显著抑制C6胶质瘤细胞株生长,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关,且凋亡率随As2O3作用的时间和剂量的增加而增加。但As2O3对正常神经胶质细胞生长的抑制作用较弱,提示As2O3抑制细胞生长的作用具有一定的选择性。     

小鼠神经干细胞对胶质瘤趋向性实验研究

目的 探讨小鼠神经干细胞（NSCs）在体外和体内对胶质瘤细胞的趋向性。方法 将原代培养6d的小鼠NSCs悬液离心、收集备用。制备C6胶质瘤细胞、3T3成纤维细胞爬片，随后与NSCs共同培养3d。用荧光染料Hoeehst33342标记NSCs，借助立体定向技术于胶质瘤动物模型内接种NSCs，观察NSCs在胶质瘤动物模型脑内的分布情况。结果 小鼠NSCs对C6细胞有明显的趋向性。体内实验见肿瘤组织内满布标记的NSCs。结论 小鼠NSCs无论在体外或体内对胶质瘤细胞均有一定的趋向性。     

砷剂对胶质瘤细胞的促凋亡作用

目的 研究三氧化二砷(As2O3)对不同胶质瘤细胞系的作用以及机制.方法 应用MTT法观察As2O3对细胞生长的影响,并用透射电镜、Hoechst 33342/PI双染荧光和TUNEL观察C6胶质瘤细胞与9L胶质肉瘤细胞凋亡的形态变化;Annexin-v-FITC/PI双标记法检测细胞凋亡率.结果 MTF法发现As2O3在0.5-8.0μmol/L的浓度均可显著抑制C6与9L胶质瘤细胞株的生长;透射电镜、Hoechst 33342/PI双染荧光和TUNEL观察均显示两种胶质瘤细胞发生了显著的凋亡形态改变;Annexin-v-FITC/PI法检测显示随As2O3浓度的增大和时间的延长,C6与9L胶质瘤细胞株的凋亡率明显上升,而在相同时间及浓度下9L胶质瘤细胞株凋亡率要小于C6胶质瘤细胞株.结论 As3O3可诱导C6和9L胶质瘤细胞株产生凋亡,并且其作用具有选择性.     

骨髓间充质干细胞静脉注射移植对脑缺血大鼠脑内神经细胞增殖和分化的影响

目的观察骨髓间充质干细胞（bone marrow stromal cells,BMSCs）经静脉注射移植对缺血/再灌注脑内神经细胞增殖和分化的影响。方法体外培养和扩增成年雄性大鼠BMSCs;以“四管阻断法”制作大鼠前脑缺血/再灌注模型;造模后3、5、7d通过尾静脉注射Hoechst33342标记的BMSCs（2×10^6/1ml/只）,另设对照组于相同时间点通过尾静脉注射载体溶液。于造模后4周处死大鼠,取脑切片,HE染色观察大鼠海马缺血性损伤情况;BrdU/GFAP、BrdU/MAP2和BrdU/Hoechst33342免疫荧光双标染色,观察大鼠脑内神经细胞的增殖及分化情况。结果BMSCs移植组海马CA1区存活锥体细胞数显著多于载体溶液对照组（P〈0.05）。BMSCs移植大鼠脑内海马结构BrdU阳性细胞数显著多于载体溶液对照组（P〈0.05）,BrdU/MAP-2双标阳性细胞占BrdU阳性细胞的比例显著高于载体溶液对照组（P〈0.05）。结论BMSCs经静脉注射移植能够减轻缺血性脑损伤,促进宿主脑内自体神经细胞增殖,并提高其分化为神经元样细胞的比例。     

三种鼠脑胶质瘤模型的建立与比较

目的 ;建立GL261胶质瘤细胞C57BL/6小鼠、C6胶质瘤细胞SD大鼠及BALB/c小鼠皮下动物模型,比较其肿瘤生长特点。方法借助动物立体定向仪,将体外培养小鼠GL261、大鼠C6胶质瘤细胞分别接种于C57BL/6小鼠及SD大鼠右侧尾状核区,C6胶质瘤细胞接种于BALB/c小鼠左前肢皮下。接种后观察不同种实验鼠的生存状态及肿瘤的生长特性,颅内模型于接种后7d、14d、21d、28d进行MRI检查,皮下模型测量体积,并绘制生长曲线。解剖标本,做组织病理学和胶质纤维酸性蛋(GFAP)免疫组化检查。结果 GL261胶质瘤细胞C57BL/6小鼠模型较之后两种模型在组织病理学上接近人脑胶质瘤,而且颅内生长稳定,成瘤率高,未见颅外转移病灶,实验周期短,重复性好。结论 GL261胶质瘤细胞C57BL/6小鼠模型,其肿瘤生长特性及病理特征与人脑胶质瘤相似,可作为临床胶质瘤基础研究的理想模型。     

骨髓间充质干细胞向脑胶质瘤趋向性的初步研究

背景骨髓间充质干细胞(MSCs)是存在于骨髓中的非造血类干细胞,具有自我更新及多向分化潜能.在大鼠脑外伤模型中的迁移能力已得到证实,而其对于脑胶质瘤的趋向性的研究尚处于初期.本实验通过将标记的MSCs移植到大鼠脑胶质瘤模型体内,观察它的迁移情况.方法采用全骨髓细胞培养法,利用MSCs的贴壁生长及可在体外长期培养的特性,获取纯化的MSCs.采用流式细胞术鉴定其表面抗原及细胞周期.在处于对数生长期的MSCs培养皿中加入BrdUrd(终浓度10μg/mL),培养24～48 h后进行移植.采用立体定向技术建立大鼠脑胶质瘤模型,3 d后移植标记好的MSCs在大脑半球组,BrdUrd标记的MSCs被注入大鼠脑胶质瘤模型肿瘤对侧大脑;在颈内动脉组,BrdUrd标记的MSCs被注入大鼠脑胶质瘤模型肿瘤同侧的颈内动脉.分别以BrdUrd标记的3T3细胞作为对照组.2周后,处死大鼠取脑组织制作病理切片,进行抗BrdUrd免疫组化及免疫荧光染色,观察MSCs的迁移情况.结果全骨髓培养法获得了纯化的MSCs.移植到脑组织及颈内动脉的BrdUrd标记的MSCs表现出了明显的向脑胶质瘤迁移的特性.在大脑半球组,MSCs主要集中在肿瘤与正常脑组织的交界部位,在瘤内只有少量分布.在颈内动脉组,MSCs主要分布于肿瘤内部,在肿瘤与正常脑组织的交界位置有少量分布.结论MSCs具有明显的向脑胶质瘤迁移的特性,同时亦可通过血脑屏障,有可能成为胶质瘤基因治疗的理想载体.     

大鼠骨髓基质细胞移植治疗胶质瘤的实验研究

目的将Wistar大鼠骨髓基质细胞体外移植入C6胶质瘤大鼠模型,观察其生物学特性及大鼠存活状态。方法建立C6载瘤模型和骨髓基质细胞移植治疗模型;待术后生长至3w和4w时行MRI检测;不同时间段内大鼠脑标本行免疫组化染色。结果骨髓基质细胞移植组模型平均生存时间为4.03w;对照组平均生存时间为3.88w;且其平均肿瘤体积与对照组无明显差异。大鼠体内移植体外培养5月余的骨髓基质细胞未发现肿物生成。骨髓基质细胞包绕在胶质瘤周围,对胶质瘤细胞有定向靶向作用。结论骨髓基质细胞对胶质瘤有定向靶向作用,可以安全的作为生物载体转染目的基因治疗胶质瘤。     

大鼠束缚后脑内小胶质细胞的反应

目的　 探讨大鼠束缚后脑内小胶质细胞的反应及其时程变化。 方法　 将大鼠束缚于小的塑料桶内 1,3或 6h ,于解束后 30min被处死 ,脑组织进行抗OX4 2 (小胶质细胞的特异性标记物 )免疫组织化学染色。结果 　正常大鼠脑内的小胶质细胞一般为静息状态 (静息型 ) ,其特点是OX4 2为阴性或浅染 ,在切片上不易发现或细胞形态不清晰。束缚 1h后 ,小胶质细胞为轻度反应 ,OX4 2浅染 ,细胞形态隐约可见 ,仅于下丘脑的视上核、室旁核和弓状核有散在的表达。束缚 3h后 ,小胶质细胞的反应达到高峰 ,由静息状态变为早期反应状态 (早期反应型 ) ,OX4 2深染 ,细胞形态清楚 ,突起上可见到小棘。早期反应型小胶质细胞广泛分布于前脑 :扣带回、新皮质浅层、隔外侧核、海马CA3、齿状回、杏仁中央核 ;间脑 :下丘脑视前区、视上核、室旁核、第三脑室周区、弓状核、丘脑室旁核、外侧膝状体、内侧膝状体 ;脑干 :中脑的上丘视性层、中脑导水管周围灰质、下丘的皮质部 ;脑桥的外侧臂旁核、蓝斑、A5区 ;延髓的延髓内脏带 (MVZ)和三叉神经脊束核等处 ;束缚 6h后 ,小胶质细胞反应减弱 ,OX4 2浅染 ,分布范围减少 ,主要出现于扣带回、隔外侧核、海马、视上核、室旁核、中脑导水管周围灰质、脑桥的臂旁外侧核、蓝斑、延髓的延髓内脏带 (M     

人羊膜上皮细胞侧脑室移植治疗脑出血大鼠实验研究

目的 探讨人羊膜上皮细胞(hAECs)侧脑室移植对脑出血(ICH)大鼠脑水肿与神经功能恢复的影响.方法 分离培养hAECs,用Hoechst33258和增强绿色荧光蛋白(EGFP)标记hAECs,将其移植入脑出血大鼠侧脑室中,测试大鼠28 d内的运动功能变化与脑水肿的动态变化,并行免疫组织化学观察.结果 移植hAECs沿大鼠侧脑室壁生长,细胞存活4 w以上.巢蛋白(nestin)与波形蛋白(vim)免疫组化检测呈阳性表达,病灶周围小胶质细胞OX-42染色阳性细胞减少.移植组ICH大鼠脑含水量减少,神经功能明显改善.结论 hAECs移植到ICH大鼠侧脑室可存活,表达神经元特异性抗原,并减轻ICH大鼠脑水肿,改善运动功能.     

三氧化二砷诱导9L胶质瘤细胞凋亡的实验研究

目的研究三氧化二砷（As2O3）对鼠胶质瘤生长的影响及其机制。方法应用不同浓度As2O3,分别处理9L胶质瘤细胞株不同时间,采用四甲基噻唑蓝比色（MTT）法观察As2O3对9L胶质瘤细胞生长的影响,以透射电镜、Hoechst 33342/PI双染荧光及流式细胞仪检测9L胶质瘤细胞凋亡。结果不同浓度的As2O3均可显著抑制9L胶质瘤细胞株的生长。As2O3作用可引起9L胶质瘤细胞的凋亡,且随As2O3浓度的增大和作用时间的延长,9L胶质瘤细胞的凋亡率明显上升。结论As2O3在体外可显著抑制9L胶质瘤细胞生长,其机制与诱导肿瘤细胞凋亡有关,且其凋亡率随As2O3作用的时间延长和剂量的增加而增加。     

外源性TRAIL基因转染对胶质瘤C6细胞凋亡的实验研究

目的探讨外源性肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL）基因对大鼠C6胶质瘤细胞的凋亡作用。方法C6细胞在杜伯改良的Eagle培养基（DMEM）,37℃,5％CO2条件下培养;质粒提取与转染;用HoeChst试剂盒检测C6细胞凋亡。结果转染重组质粒PDC315-TRAIL的C6细胞组凋亡率明显高于未转染的C6细胞组及转染空载体PDC315的C6细胞组（P〈0．05）。结论外源性TRAIL基因可引起C6细胞凋亡。     

肿瘤干细胞致敏的树突状细胞对脑胶质瘤细胞免疫的影响

目的 研究肿瘤干细胞(BTSCs)致敏的树突状细胞(DCs)疫苗对颅内荷瘤小鼠的治疗作用.方法 无血清培养基中加入表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子,将C6胶质瘤细胞诱导成胶质瘤干细胞,以此致敏大鼠骨髓来源的树突状细胞制备疫苗;立体定向建立大鼠颅内C6胶质瘤模型,分为A、B、C、D四组.每组分别经尾静脉注射1×107BTSCs致敏的DCs(DCs-BTSCs)、1×107 C6胶质瘤细胞致敏的DCs(DCs-C6)、1×107DCs及PBS,Kaplan-Meier法对大鼠生存情况进行分析,大鼠脑组织标本行HE染色及免疫组化分析.结果 胶质瘤干细胞CD133+及nestin染色阳性;DCs具有典型的树突状结构,特异性标志OX62+表达阳性;生存时间A组较其他组明显延长,Log-rank检验差异有统计学意义(P＜0.05);A组HE染色炎性细胞浸润最多,免疫组化可见较多的CD8+T淋巴细胞.结论 肿瘤干细胞致敏的树突状细胞疫苗能明显提高机体对胶质瘤的免疫力,其作用优于胶质瘤细胞致敏的树突状细胞疫苗,为树突状细胞疫苗的临床应用提供了新的依据.

Abstract：

Objective To investigate the effect of dendritic cells pulsed with brain tumor stem cells which are used to treat on intracranial glioma.MethodWe obtained murine brain tumor stem cells by growing C6 cells in epidermal growth factor/basic fibroblast growth factor without serum.Dendritic cells isolated from rat bone marrow were pulsed with BTSCs.Rat brain glioma models were established by stereotactic technique.107 DCs pulsed with BTSCs and C6 were injected through tail vein in group A and group B respectively.The same number of DCs and the same volume PBS were applied to group C and group D.The survival time of rats was analyzed by Log- rank survival analysis.Tumor samples were examinedwithHE staining and immunohistochemistry.Methods BTSCs expressedCD133 + and nestin.DCs appeared typical long dentrite in morphology and expressed OX62+ markers.The survival analysis showed group A was statistically significant in constrast to the other goups (P<0.05).The tumors in group A have the most inflammation and CD8 + T lymphocytes.Concluion DCs loading with BTSCs lysates can provide a higher level of immunity protect against gliomas than those loading with C6 cells,which provide a new method in the immuntherapy of brain glioma.     

DAPI标记骨髓间充质干细胞在胶质瘤模型大鼠脑内的迁徙和定位

背景：骨髓间充质干细胞作为载体细胞行脑内移植治疗胶质瘤,如何证实其为最好的药物载体？ 目的：将DAPI标记的大鼠骨髓间充质干细胞移植入模型鼠脑内,观察骨髓间充质干细胞在肿瘤内的迁徙与定位。 方法: 体外培养骨髓间充质干细胞。利用立体定向仪将培养好的C6细胞注入大鼠脑内,建立大鼠脑内胶质瘤模型。将DAPI标记于培养好的骨髓间充质干细胞上,利用微量注射器注入模型鼠脑内;移植后第3,7天处死大鼠,利用共聚焦显微镜观察骨髓间充质干细胞在肿瘤内的分布及与肿瘤细胞的关系。 结果与结论:实验成功建立了大鼠脑内胶质瘤模型。以DAPI标记的骨髓间充质干细胞。在模型鼠脑内主动聚集于肿瘤血管周围,并能与肿瘤细胞发生融合。结果证实骨髓间充质干细胞可以作为肿瘤基因治疗的良好载体。     

异柠檬酸脱氢酶1基因突变增加胶质瘤细胞对替莫唑胺的敏感性

目的探讨胶质瘤细胞异柠檬酸脱氢酶1（IDHl）基因突变对替莫唑胺（TMZ）细胞毒性的影响。方法将培养的U87胶质瘤细胞分组转染含空载体（空载体组）、野生型IDHl基因（野生组）和R132H突变型IDHl基因（突变组;IDHl第132位的精氨酸被组氨酸所取代）质粒,利用液相色谱串联质谱法检测细胞上清液中2-羟基戊二酸（2-HG）水平、噻唑蓝法检测细胞增殖活性、实时荧光定量PCR法和免疫印迹法检测细胞caspase3mRNA和蛋白质表达;将含三种不同质粒的U87细胞接种大鼠建立荷瘤大鼠模型并观察大鼠经TMZ治疗后60d存活率。结果与空载体组和野生组比较,突变组细胞上清液中2-HG水平、细胞caspase3mRNA和蛋白质表达水平均显著升高（P〈0．05）,而细胞增殖活性显著下降（P〈0．05）;TMZ治疗后60d,突变组大鼠存活率显著升高（P〈O．05）;空载体组和野生组之间均无统计学差异（P〈0．05）。结论IDHlR132H基因能够增加TMZ对神经胶质瘤细胞的细胞毒性作用并提高其治疗荷瘤大鼠的存活率。     

大鼠脑干胶质瘤模型的建立及MRI特点

目的 建立大鼠脑干胶质瘤模型,并研究成瘤鼠运动功能及胶质瘤MRI成像特点.方法 采用大鼠脑立体定向仪,将C6胶质瘤细胞接种至SD大鼠脑干内.MRI动态观察肿瘤生长情况,并观察接种C6胶质瘤细胞后大鼠的运动能力、生存周期等.结果 C6胶质瘤细胞接种成功率为100%.生存分析表明:大鼠于接种后第16～22天死亡.接种后第7天,MRI即可检出肿瘤生长,荷瘤鼠的运动能力随着成瘤时间的推移逐渐减弱.结论 大鼠脑干胶质瘤模型成瘤率高,有良好的可重复性和可预测性.MRI观察该模型具有脑干胶质瘤成像的特点,细胞接种后10～18 d是最佳观测期.