氧化应激对大鼠髓核细胞凋亡的影响*

细胞凋亡在椎间盘退变过程中发挥重要作用,而导致细胞凋亡的因素很多,氧化应激是导致细胞凋亡的一个重要因素。 目的：从细胞内信号转导水平验证过氧化氢对大鼠髓核细胞氧化应激损伤的影响。 设计、时间及地点：单一样本观察,试验于2008-03/10在山东省创伤骨科研究所完成。 材料：p38MAPK特异性阻断剂(SB203580)、JNK特异性阻断剂(SP600125)购自碧云天生物技术有限公司;大鼠椎间盘来自2只新生24 h SD大鼠。 方法：原代培养大鼠髓核细胞,将生长良好的髓核细胞制成细胞悬液,随即分为4组：H202组：用0,50,100,200,400,800 μmol/L H2O2刺激;对照组：不加刺激的细胞;SB203580+H2O2组：给予特异性p38MAPK阻断剂SB203580预孵育细胞,再给予H2O2刺激;SP600125+H2O2组：给予特异性JNK阻断剂SP600125预孵育细胞,再给予H2O2刺激。上述处理后检测相关指标。 主要观察指标：以免疫组织化学检测P-p38和P-JNK的表达情况及表达位置;Western印迹法检测SAPK/JNK、p38MAPK及其磷酸化组分的表达。 结果：H2O2能够激活髓核细胞内p38和JNK的活性;SB203580能够有效地抑制p38MAPK的活性,而SP600125则能够有效的抑制JNK的活性;免疫荧光显示P-p38MAPK和P-JNK在细胞质和细胞核均有表达中,而对照组未发现。 结论：大鼠髓核细胞受氧化应激后可通过p38MAPK和JNK通路导致细胞凋亡。     

JNK信号转导通路在Aβ25-35诱导大鼠原代海马神经元凋亡中作用机制的研究

目的 研究Aβ25-35诱导海马神经元凋亡的机制以及JNK抑制剂SP600125的保护作用，探讨在Aβ25-35细胞毒性中JNK-c-Jun信号转导通路的可能作用机制。方法 将体外海马原代神经元培养至第7天，用β淀粉样蛋白25-35片段(Aβ25-35)和JNK抑制剂(SP600125)对细胞进行处理。用光镜进行海马原代神经元形态学观察，MTT检测不同时间点的细胞活性，以及用免疫印迹法检测不同时间点的JNK及c-Jun蛋白活性。结果 大鼠原代海马神经元经过Aβ25-35处理后，发生凋亡，细胞生存率呈时间依赖性下降，经过免疫学方法检测发现细胞在Aβ25-35处理早期出现磷酸化JNK和磷酸化c-Jun的表达增高，且这一过程可被SP600125抑制。MTT检测发现在使用SP600125后，细胞生存率上升，具有显著性差异。结论 体外原代海马神经元培养实验表明Aβ25-35在诱导原代海马神经元凋亡过程中，c-Jun氨基端激酶(JNK)及其底物转录因子c-Jun被激活。使用JNK抑制剂SP600125后，JNK和c-Jun均被抑制，且海马原代神经元的生存率明显提高，生存状态明显改善。研究表明JNK信号转导通路可能促成Aβ的细胞毒性作用。     

Aβ1-40诱导的神经干细胞凋亡中钾通道和JNK信号转导通路的作用

目的探讨Aβ1-40诱导的神经干细胞凋亡中钾通道与JNK的作用,以及钾通道与JNK的关系,进一步了解AD的发病机制。方法应用MTT法、Hoechst33342法、比色法及Westernb1ot法分别检测以TEA和SP 600125作用的Aβ1-40诱导神经干细胞的存活率、凋亡发生率、Caspase-3活性的改变及JNK磷酸化的情况。结果预先加入TEA使Aβ1-40诱导的神经干细胞的存活率增加,凋亡减少;JNK的选择性阻断剂SP 600125可显著的保护Aβ1-40诱导的神经干细胞的凋亡。在Aβ1-40孵育前30min加入TEA,与Aβ1-40共同孵育24h,TEA使JNK的磷酸化表达显著降低。结论 Aβ1-40可以使神经干细胞发生凋亡。钾通道在Aβ1-40诱导的神经干细胞凋亡时被激活,TEA可以明显减轻Aβ1-40诱导的神经干细胞的凋亡。Aβ1-40诱导神经干细胞后JNK信号转导通路参与了凋亡的发生,SP600 125对Aβ1-40诱导的神经干细胞具有明显的保护作用。TEA作用于Aβ1-40诱导的神经干细胞可以使JNK蛋白表达下降,说明Aβ1-40引起的钾通道激活和JNK磷酸化两者之间有一定的相互联系,进而诱发了下游凋亡相关蛋白的改变。     

溶血磷脂酸诱导PC12细胞凋亡的机制研究

目的 探究溶血磷脂酸诱导PC12细胞凋亡的机制并提出干预措施。方法 实验1:不同浓度LPA(0 μM 、10 μM、20 μM、40 μM)处理PC12细胞24 h; 实验2:LPA(40 μM)分别处理PC12细胞不同时间(0 h、6 h、12 h、24 h); 实验3:正常组(0 μM LPA)、LPA组(40 μM LPA)和干预组(5 μM SP600125预处理2 h+40 μM LPA)培养24 h; CCK-8检测细胞活力; TUNEL染色检测细胞凋亡比例; WesternBlot检测Bcl2、caspase 3、磷酸化JNK水平。结果 LPA以时间依赖和浓度依赖的方式使PC12细胞的细胞活力和Bcl2水平降低,而使PC12细胞的凋亡指数和caspase 3水平增高; SP600125(5 μM)预处理不仅明显阻断LPA诱导的PC12细胞活力下降、细胞凋亡,并且极大地抑制了LPA诱导的JNK通路的激活、Bcl2水平的下调和caspase 3水平的上调。结论 JNK特异性抑制剂SP600125预处理能够明显阻断LPA诱导的PC12细胞损伤。     

脂多糖诱导血脑屏障破坏中JNK信号通路与基质金属蛋白酶-9作用机制的研究

目的探讨在脂多糖(LPS)诱导血脑屏障(BBB)破坏中紧密连接Occludin、ZO-1表达的变化以及c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路与基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的作用机制。方法利用MTT法检测不同浓度LPS以及SP600125(JNK信号通路抑制剂)对人脑微血管内皮细胞(h CMEC/D3)活力的影响。Western blot法检测不同浓度LPS对Occludin、ZO-1蛋白表达的影响。用SP600125阻断JNK信号通路,Western blot法检测LPS诱导的JNK磷酸化水平、Occludin和ZO-1蛋白表达的变化,qRT-PCR法检测Occludin、ZO-1及MMP-9 mRNA表达的变化。用SB-3CT特异性抑制MMP-9活性,Western blot法检测LPS诱导的Occludin蛋白表达的变化。结果 LPS、SP600125浓度分别在10μg/ml(0.19±0.02)和0.22μg/ml(0.18±0.01)以下时对h CMEC/D3细胞活力无明显影响(P>0.05)。不同浓度LPS(1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml)处理h CMEC/D3后Occludin和ZO-1蛋白的表达量均下降。LPS处理h CMEC/D3后JNK磷酸化水平增高,而抑制JNK磷酸化可以明显上调LPS诱导的Occludin蛋白(0.87±0.03、P<0.001)及其mRNA(1.00±0.09、P<0.05)的表达,但对ZO-1蛋白(1.14±0.06、P>0.05)及其mRNA(0.81±0.03、P>0.05)的表达无明显影响。另外,抑制MMP-9的活性可以明显上调Occludin蛋白的表达(0.53±0.06、P<0.01),阻断JNK信号通路可显著降低LPS诱导的MMP-9的高表达(0.77±0.08、P<0.001)。结论 LPS可下调紧密连接Occludin、ZO-1蛋白及其mRNA的表达导致血脑屏障破坏;LPS可通过激活JNK信号通路,调节Occludin蛋白及其mRNA的表达,而对ZO-1蛋白及其mRNA表达的影响可能通过其他信号通路实现;LPS诱导Occludin蛋白的下调可能与MMP-9的高表达有关,JNK信号通路可能参与了此过程的调控。     

LPA通过JNK磷酸化诱导PC12细胞焦亡

目的 探讨溶血磷脂酸(LPA)能否诱导PC12细胞焦亡及其机制。方法 浓度梯度实验:不同浓度的LPA(0、20、40、60 μM)处理PC12细胞24 h,用CCK-8检测细胞活力; Hochest33342/PI 染色检测细胞膜破裂及坏死; 蛋白免疫印迹检测焦亡相关指标(NLRP3,ASC,caspase-1,IL-1β)的表达水平以及p-JNK和JNK的表达水平; JNK抑制剂实验分为4组,即CTR组(0 μM LPA),LPA 组(20 μM LPA),SP600125组(5 μM SP600125),LPA+SP600125组(20 μM LPA+5 μM SP600125),用免疫印迹检测caspase-1及IL-1β的表达水平。结果 LPA呈水平依赖降低PC12细胞活力,诱导PC12细胞坏死使PI阳性细胞数增加,并使焦亡相关指标(NLRP3,ASC,caspase-1,IL-1β)的表达水平升高以及p-JNK和JNK的水平增高。JNK抑制剂SP600125(5 μM)可以极大地抑制LPA诱导的PC12细胞焦亡相关指标caspase-1及IL-1β的表达。结论 LPA通过JNK磷酸化诱导PC12细胞焦亡,SP600125可以挽救此过程     

铜诱导原代皮层神经元凋亡的信号传导通路研究

目的 研究铜诱导皮层神经元凋亡的机制以及凋亡信号调节激酶-1(ASK1)抑制剂硫氧还蛋白(trx)的保护作用,探讨ASK1介导的c-Jtm氨基末端激酶(JNK)/caspase-3信号传导通路的可能作用机制. 方法 醋酸铜和trx预处理体外培养的原代皮层神经元,MTT法检测神经元活力,Annexin-V/PI法检测神经元凋亡,Western blot检测不同浓度和时间点磷酸化的ASK1、JNK和caspase-3蛋白表达. 结果 体外培养原代皮层神经元经醋酸铜诱导后,凋亡率上升,细胞活力下降,浓度越大下降越多,trx能拮抗此作用.Western blot检测发现磷酸化ASKl和JNK在4h时开始出现升高,48h表达达到高峰,呈时间和浓度梯度依赖;活化的caspase-3在24h出现活性表达,48h达到高峰.使用trx后,磷酸化ASK1、JNK和caspase-3蛋白表达减少,细胞凋亡率下降,活力升高,差异有统计学意义(P＜0.05). 结论 铜能诱导体外培养原代皮层神经元发生凋亡,ASK1介导的JNK/caspase-3信号转导通路在铜的神经元毒性过程中发挥了重要作用:trx对铜沉积导致的皮层神经元损伤可能起到保护作用.     

SP600125对大鼠肝缺血再灌注损伤的保护作用

背景：SP600125作为JNK激酶抑制剂,可特异性阻断JNK细胞转导通路,对肝脏缺血再灌注又起到怎样的作用,目前尚无相关研究。 目的：应用SP600125对肝脏缺血再灌注进行干预,分析JNK信号转导通路在该病理生理过程中的作用。 方法：将30只雄性SD大鼠按随机数字表法分为3组,假手术组、缺血再灌注组及SP600125组各10只。假手术组仅行进腹手术;缺血再灌注组行进腹手术,阻断肝左中叶的血供;SP600125组于术前半小时腹腔注射SP600125 15 mg/kg,其他操作同缺血再灌注组。于复灌后2 h取材,分别测定各组血清肝功能酶活性,通过苏木精-伊红切片染色观察肝组织结构的病理变化,运用免疫组织化学法检测肝组织中p-JNK表达并进行半定量分析,以比色法检测肝脏丙二醛含量及髓过氧化物酶活性。 结果与结论：相对于缺血再灌注组,SP600125组血清肝功能酶活性明显下降,肝脏p-JNK表达较低,肝脏髓过氧化物酶活性以及丙二醛含量下降,病理损伤有所缓解。提示JNK细胞信号转导通路在肝缺血再灌注损伤过程中被广泛激活,应用JNK抑制剂SP600125对缺血再灌注损伤有保护作用。     

舒马普坦通过细胞外信号调节激酶1/2和c-Jun氨基末端激酶信号通路下调三叉神经节内降钙素基因相关肽的表达

目的 探讨舒马普坦对大鼠三叉神经节(TG)离体培养后降钙素基因相关肽(CGRP)表达水平的影响.方法 采用TG离体培养模型,按数字随机表法将54个TG随机分为新鲜组(6个)、对照组(6个)和实验组(7个亚组,每亚组6个,共42个).实验组TG培养液中分别加入4种不同浓度舒马普坦,细胞外信号调节激酶1/2 (ERK1/2)信号通路阻滞剂U0126和PD98059,c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路阻滞剂SP600125,孵育24h后免疫组织化学染色检测CGRP免疫反应(CGRP-ir)阳性细胞表达,实时定量PCR检测CGRP-mRNA表达量,Western blot定量磷酸化ERK1/2( pERK1/2)和JNK (pJNK)蛋白水平.结果 离体培养24h后,TG内CGRP-ir(+)细胞表达明显增高,0.1和0.5 mg/ml舒马普坦组CGRP-ir(+)细胞百分比、阳性面积、累积吸光度、平均吸光度、CGRP-mRNA水平较对照组明显下降(tPCP=8.652、26.382,tares=6.220、13.917,tIA=5.606、15.904,tM14=2.661、21.748,tmRNA=8.032、15.675,均P＜0.05);而0.02和2.50 mg/ml舒马普坦与对照组CGRP表达差异无统计学意义.Western blot结果显示:0.50 mg/ml浓度舒马普坦显著降低TG内pERKl/2、pJNK水平,降低程度分别接近于10μmol/L的U0126、PD98059和SP600125.结论 一定浓度舒马普坦通过细胞内ERKl/2、JNK信号通路下调大鼠TG离体培养后CGRP的过度表达.     

N-乙酰半胱氨酸防止帕金森病鼠黑质神经元凋亡

目的:研究N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcystein,NAC)对1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine,MPTP)诱导的帕金森病小鼠黑质神经元凋亡的保护机制.方法:采用MPTP制备帕金森病(Parkinson disease,PD)小鼠模型,应用生化技术检测黑质区域谷胱甘肽(GSH)浓度及超氧化物歧化酶(SOD)活力,用尼氏(Nissl)染色、TH组化染色、活化型Caspase 3组化染色及TUNEL染色观察黑质神经元的损害情况,并计算神经元的凋亡率,同时应用蛋白免疫印迹法检测黑质神经元磷酸化JNK及磷酸化c-Jun蛋白表达水平.另经NAC预处理该模型后,对上述指标进行检测.结果:NAC预处理能提高黑质区域GSH的浓度及降低SOD活力,减轻PD鼠黑质致密带Nissl阳性神经元和TH阳性神经元的脱失现象,减少磷酸化JNK及磷酸化c-Jun蛋白表达水平,使活化型Caspase 3表达减少并降低黑质神经元的凋亡率.结论:NAC能减少MPTP诱导的小鼠黑质神经元凋亡,其机制与抗氧化及阻断JNK细胞凋亡通路的激活有关.