只产阿维菌素B组分的基因工程菌的构建

目的通过对阿维菌素生物合成基因C5-O-甲基转移酶基因(aveD)内部进行缺失,使aveD基因失活,从而获得只产生阿维菌素B组分的基因工程菌。方法构建大肠杆菌-链霉菌重组质粒pZHJ06,通过接合转移将缺失部分片段的aveD基因以双交换的方式整合到阿维链霉菌的染色体上。采用摇瓶进行发酵,采用高效液相色谱(HPLC)检测发酵液中阿维菌素的组分。结果重组菌株不再产生阿维菌素A组分,只产生阿维菌素B组分,并且B组分的总产量也有所提高。结论将阿维链霉菌的aveD基因失活,并不影响下游酮基还原酶基因(aveF)基因的表达,重组菌株只产生阿维菌素B组分。     

妥布霉素发酵中的二次生长

黑暗链霉菌产生次级代谢产物妥布霉素的过程与供氧条件密切相关。通过对常规发酵的溶氧和残糖变化规律研究发现发酵后期有菌体的二次生长现象,影响了妥布霉素的分泌。采用在发酵后期降低转速的方法抑制发酵过程中黑暗链霉菌的二次生长,延长了妥布霉素的分泌期,使最终效从比常规发酵提高了27%。     

双拷贝aveC基因对阿维菌素产量的影响

目的通过在阿维链霉菌染色体上增加aveC基因的拷贝数,提高阿维菌素"1"组分的产量。方法采用基因工程技术,在阿维链霉菌染色体DNA的bkdAB基因中插入一套aveC基因,通过同源双交换得到重组菌株,采用HPLC考察各组分的含量。结果第二套aveC基因正确地插入到基因组DNA的预定部位。然而,对重组菌株发酵产物的HPLC分析显示,阿维菌素"1"组分比例并没有明显的变化,但B1a效价却有显著提高。结论aveC基因产物的活性可能不是决定阿维菌素"1"组分比例的主要因素,但aveC基因产物的活性可能是阿维菌素生物合成的限制因素。     

卡那霉素链霉菌诱变育种和发酵的研究

抗生素的生物合成受产生菌调节机制的限制。产生调节作用的内部原因来自染色体或质粒DNA,外部原因是环境诸因素。因此,可以从遗传和环境两个方面控制产生菌的调节作用,从而提高抗生素的产量和质量。 本文介绍卡那霉素链霉菌诱变育种和发酵条件试验所取得的成果,并对诱变育种及其发酵等问题作了初步的讨论。 材料和力法 一、出发菌种:卡那霉素链霉菌(Streptomyces kanamyceticus)575 二、培养基:下述培养基用自来水配     

氮离子注入法选育春雷霉素高产菌株和生产发酵

目的以氮离子束注入法对春雷霉素产生菌进行诱变育种,获得高产菌株。方法以小金色链霉菌(Streptomyces microaureus)US17为出发菌株,采用不同剂量的氮离子注入法处理该菌株,经过摇瓶初筛、复筛和上罐发酵,确定生产性状优良的菌种。结果经过诱变处理和筛选后,获得4株高产菌株。其中K1999.2010S247菌株摇瓶效价达到27 546mg·L-1。经25吨罐生产验证,平均发酵效价比原工业生产菌株提高了5.44%,组分含量质量分数提高了4.5%。结论采用离子束注入法对春雷霉素产生菌诱变育种效果显著,所获得高产菌株发酵效价高、组分含量高,产生巨大的经济效益,适合工业生产发酵使用。     

提高白色链霉菌盐霉素产量的工艺研究

以白色链霉菌SL—F2—110为产生菌，着重从菌种选育和补料工艺两方面研究提高白色链霉菌的盐霉素产量。结果表明，①氯化锂前处理与紫外线复合处理后筛选出的突变株盐霉索发酵产量有很大提高；②在基础培养基中减少豆油加量，采用中间补豆油控制，发酵水平与没有补料的相比有较大提高。     

利用基因工程技术选育氨甲酰妥布霉素高含量菌种

目的以产生安普霉素、氨甲酰妥布霉素和氨甲酰卡那霉素3个组分的黑暗链霉菌为出发菌株,利用基因工程技术选育氨甲酰妥布霉素含量高的菌种。方法克隆安普霉素生物合成基因,通过基因阻断技术破坏安普霉素生物合成基因,阻断安普霉素生物合成。结果获得了氨甲酰妥布霉素含量高的菌种。结论利用基因工程技术可以有效地改良抗生素组分。     

阿维链霉菌中aveD基因插入失活产生的异常组分

目的 探索阿维链霉菌中aveD基因插入失活后对发酵产物组分的影响.方法采用将抗生素(安普霉素)抗性基因插入到aveD基因的方法,构建了重组质粒pID03;利用接合转移的方法将重组质粒导人到阿维链霉菌S-2(Streptomyces atwraitilis S-2)菌株中,并通过抗性标记筛选双交换的菌株.结果得到了aveD基因插入失活的菌株AveD24.该菌株不再产生4个A组分,只产生4个B组分,同时还产生2个异常的组分,经HPLC和质谱分析,初步确定异常组分D24-1为寡霉素A,另一异常组分D24-2为5-酮avermectin 1a.     

通过获得链霉素抗性基因(str)突变株筛选梅岭霉素高产菌株

本文通过链霉素对梅岭霉素（meilingmycin）产生菌南昌链霉菌NS－41－80菌株孢子致死浓度的测定，采用诱变剂EMS四种不同诱变剂量对菌株的孢子进行诱变处理，诱变处理的孢子涂布在含链霉素致死浓度的高氏平板上，获得了大量的链霉素抗性基因（str）突变株。然后从链霉素抗性基因突变株进一步筛选到梅岭霉素高产菌株80－5．11－221，在摇瓶条件下，只产梅岭霉素不产南昌霉素，梅岭霉素活性效价达1500μg/ml，比出发菌株NS－41－80的摇瓶发酵效价855μg/ml提高了77．9％，该菌株连续传代六代进行摇瓶发酵，其F2代和F3代梅岭霉素发酵效价稳定，F4代至F6代随着传代数增加，其梅岭霉素发酵效价急速下降。通过EMS诱变剂量分别与抗药性突变率和链霉素抗性基因突变株产梅岭霉素产量的产势统计分析表明，菌株抗药性突变与产抗生素突变密切相关，产抗生素突变的EMS诱变剂量高于链霉素抗性基因突变诱变剂量。在0．03mol/L的EMS剂量作用下，菌株致死率为99．43％，而抗药性突变率为0．0440％，建立了梅岭霉素产生菌链霉素抗性基因突变筛选方法，为南昌链霉菌高产菌种选育研究作了有益的尝试，并有助于其它链霉菌属的抗生素产生菌育种研究。     

黑暗链霉菌中安普霉素生物合成的阻断研究

以黑暗链霉菌Tt-49基因组为模板,利用PCR方法,扩增安普霉素生物合成关键基因aprH～M的上、下游序列,作为同源交换臂,并以温敏复制型质粒pKC1139为基础,构建用于阻断黑暗链霉菌Tt-49中安普霉素生物合成的重组质粒pHM106.质粒经接合转移进入黑暗链霉菌Tt-49,并筛选得到发生同源双交换工程菌,命名为黑暗链霉菌HM106.通过PCR鉴定,证明工程菌HM106中的aprH～M被tetr替换.对工程菌HM106进行发酵产物分析,结果是其发酵效价下降明显,仅为出发菌株的40％左右.采用薄层层析(TLC)对其组分分析,其安普霉素组分消失,因此,初步判断已成功阻断安普霉素的生物合成.     

米尔贝霉素A3和A4高产菌的理性选育

目的 应用理性选育理论，结合各种诱变手段，获得米尔贝霉素A4(1)，A3(2)的高产菌种。方法 以吸水链霉菌CGMCC7677为出发菌，通过紫外、甲基磺酸乙酯与常压室温等离子体等单独诱变或组合诱变，结合含甘氨酸、利福平、乙酸钠和3-溴丙酮酸的抗性平板进行筛选。结果 通过多轮的筛选，得到米尔贝霉素突变株75-22和95-23。在不改变培养基组成和培养条件的情况下，75-22在50L发酵罐中培养360h，米尔贝霉素A4(1)的生产能力提高了5倍，米尔贝霉素A4(1)的含量也从70%提高至80%以上。95-23在50L发酵罐中培养360h，米尔贝霉素A3(2)的生产能力提高了10倍，米尔贝霉素A3(2)的含量提高至70%以上。结论 主产单一组分菌种的获得，可进一步扩大米尔贝霉素的应用研究范围，也为米尔贝霉素的产业化提供了优良的菌种。     

几种调控基因对除虫链霉菌工业生产株的抗生素效价的影响

在模式链霉菌（如天蓝色链霉菌和变铅青链霉菌）中导入许多抗生索生物合成的调控基因可以大幅度提高抗生索的含量。本文报道利用链霉菌的整合质粒克隆几种已知的调控基因。并通过接合转移从大肠埃希菌中导入产生avermectin和多拉菌素的除虫链霉菌工业生产菌株中。发现3种调控基因afiR、aveR和orfX对菌株MMR630中avermectin的含量均可以提高约1倍。但是，以上的3种，加上另外3种调控基因分别导入菌株G11后，发现除aft8提高约13％外，其余调控基因使菌株产生多拉菌素的含量反而有不同程度的降低。将调控基因币B置于链霉菌强启动子PerrnE^＊下表达降低了菌株G11中多拉菌素的含量。上述结果表明，调控基因对不同链霉菌的抗生素生物合成具有不同的影响，反映了抗生素生物合成确实受到了复杂网络的调控。     

Bioconversion of milbemycin-related compounds: isolation and utilization of non-producer, strain RNBC-5-51.

A non-producing strain, the so-called strain RNBC-5-51 SANK 60198, was isolated during a screening program of strain improvement in the milbemycin production. Strain RNBC-5-51 indicated almost the same characteristics as those in the parent strain, that is, the abundant spore formation on agar media and the good growth in liquid media. But it does not produce any kind of milbemycins. In addition, strain RNBC-5-51 accumulated precursor-like compounds of milbemycin-polyketide, the production of which were inhibited by the addition of cerulenin. In the bioconversion experiments, strain RNBC-5-51 converted milbemycin beta6 and A4 to milbemycin alpha14, and milbemycin beta7 and A3 to milbemycin alpha11, respectively. This strain also converted milbemycin D and avermectin B1a, to 26-(3-methyl-2-butenoyloxy)milbemycin D and 26-(3-methyl-2-butenoyloxy)avermectin B1a, respectively. These results suggest that milbemycin alpha11 is biosynthesized through the same route as milbemycin alpha14, and the mutated step in strain RNBC-5-51 might be in the polyketide synthetic pathway of milbemycins. Strain RNBC-5-51 loses the ability for de novo synthesis of milbemycins, but it retains the ability to bioconvert the milbemycin skeleton. This strain might be useful for C-26 modification of milbemycin-related compounds.     

阿维菌素产生菌的生物技术改造研究进展

目的综述近年来运用基因工程技术对阿维菌素产生菌改良的研究进展。方法在查阅国内外文献近100篇的基础上,介绍了阿维菌素的生物合成途径,产生多组分的3个关键酶及阿维菌素产生菌改良的研究进展,包括选择性生产有效组分,产生新抗生素、杂合抗生素,改进生产工艺以及提高菌种产抗生素量。结果目前国内外均已经构建了只产生B组分及寡霉素基因缺失或失活的工程菌。分别运用突变结合理性化筛选和特定基因重组提高活性高的组分的产量,并且通过基因改造产生多种阿维菌素的衍生物;将透明颤菌的血红蛋白基因引入阿维菌素产生菌,改进氧的供应,阿维菌素的产量不断提高。阿维菌素生物合成调控机制和组合生物学改造聚酮合成酶等方面仍需深入研究。结论利用生物技术改造阿维菌素产生菌在组分改造、结构修饰、产品收率、生产工艺改进等方面已取得显著进展。对阿维菌素和其他聚酮体药物产生菌的生物合成、基因改造起着重要作用,使生产简化,成本降低,药物应用更广泛。     

Milbemycins, a new family of macrolide antibiotics. Structure determination of milbemycins D, E, F, G, H, J and K

The milbemycins, a group of potent, broad-spectrum antiparasitic and pesticidal agents, are architecturally novel antibiotics of 16-membered macrocyclic lactone. Seven new milbemycin analogues designed as milbemycins D, E, F, G, H, J and K were isolated from the fermentation broth of the mutant strain of Streptomyces hygroscopicus subsp. aureolacrimosus. The structural determination of these new components was made mainly by comparing with mass spectra, and 1H and 13C NMR spectra of milbemycin alpha- and beta-series previously published from our laboratory. Milbemycins D, E, F, G and H have characteristically an isopropyl side chain at C-25 which differs from the known milbemycin family bearing methyl or ethyl group at C-25. Milbemycins J and K possess a ketone group at C-5 instead of a hydroxyl or methoxy group. Apart from X-ray crystallography, the R-configuration of the hydroxyl group at C-5 could be best explained both by application of CD allylic benzoate method to the n-N, N-dimethylaminobenzoate of milbemycin D and by comparison of the specific rotation of milbemycin D itself and its acetate with the epimeric isomers at C-5.     

阿维菌素产生菌的诱变育种

目的提高产生菌B1a组分的产量。方法采用诱变剂亚硝基胍处理菌种 ,以含 1g·L-1甲硫氨酸的分离培养基作为定向筛选的分离平板 ,挑选生长快的菌落进行初筛、复筛。结果筛选得到高产菌株中B组分含量显著提高 ,其中得到的突变株M— 2 0经摇瓶初、复筛和传代实验表明是稳定的B组分高产变异株 ,其B组分含量达 82 1% ,较出发菌株提高 14 6 % ,其中B1组分达5 2 4 % ,较出发菌株提高 19 3%。结论采用NTG诱变结合使用含 1g·L-1甲硫氨酸的平板进行筛选可以获得阿维菌素B组分显著提高的菌株     

Avermectin产生菌异亮氨酸诱导变种的选育

用紫外线处理ａｖｅｒｍｅｃｔｉｎ（ＡＶＭ）产生菌ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓＸＣ１－２５，并在含有Ｌ－异亮氨酸（Ｌ－Ｉｌｅ）的平板培养基上筛选Ｌ－Ｉｌｅ诱导变种。结果表明：Ｉｌｅｉ变株发酵产生的ＡＶＭＢ１ａ效价高于自然分离株与紫外线诱变株，其中Ｉｌｅｉ变株ＸＣ２－２６的ＡＶＭＢ１ａ效价较亲株提高２２％。该变株经自然分离获得菌株ＸＣ３－８，其ＡＶＭＢ１ａ效价比出发菌株提高５０％以上，传代试验表明菌株ＸＣ３－８的形态和高产性能稳定，它在７ｍ３发酵罐生产试验，产生ＡＶＭＢ１ａ效价与发酵指数均比出发菌株提高５６％。     

A novel series of milbemycin antibiotics from Streptomyces strain E225. I. Discovery, fermentation and anthelmintic activity

A novel series of milbemycin antibiotics were produced by soil isolate, strain E225 which was shown to be a Streptomyces species. The antibiotics displayed anthelmintic activity against Trichostrongylus colubriformis in the gerbil. Two of the compounds, VM 44857 and VM 44866 were shown to be potent anthelmintics against mixed nematode infections in sheep.     

Bioconversion of milbemycin-related compounds: biosynthetic pathway of milbemycins.

Streptomyces hygroscopicus subsp. aureolacrimosus SANK 60286 and SANK 60576 produce many kinds of milbemycins. Among them, milbemycin alpha11, alpha14, A3, and A4 have the most effective acaricidal activity. In this study, we investigated the terminal biosynthetic pathway to milbemycin alpha14 and A4 which accumulated as the final products in these strains. Using cerulenin, a specific inhibitor of fatty acid and polyketide biosynthesis, we conducted bioconversion experiments with cultures of several mutants, including milbemycin A4- and alpha14-producing strains. The bioconversions of milbemycin beta6 to milbemycin A4 and milbemycin A4 to milbemycin alpha14 could be identified. For the biosynthesis of milbemycin A4 from milbemycin beta6 in the milbemycin A4-high producing strain, there appeared to be two separate pathways exhibiting different sequences of furan ring formation and C-5 keto reduction steps.