副黏病毒Tianjin株NP蛋白的稳定表达及其检测

目的:构建副黏病毒Tianjin株NP基因的真核表达载体,转染HEK293细胞,经G418筛选出稳定表达NP蛋白的细胞.方法:应用RT-PCR技术克隆副黏病毒Tianjin株NP基因,插入真核表达载体pcDNA3.1(+).经PCR、酶切和测序鉴定后,将构建的pcDNA3.1(+)-NP用LipofectaminenTM2000转染试剂转染HEK293细胞.应用免疫荧光法及Western Blot检测NP蛋白的瞬时和稳定表达.结果:RT-PCR扩增得到NP基因,重组质粒pcDNA3.1(+)-NP转染HEK293细胞后,经免疫荧光法检测到目的蛋白的瞬时和稳定表达.Western Blot法可见NP蛋白瞬时和稳定表达的条带.结论:副黏病毒Tianjin株NP基因在HEK293细胞可以瞬时和稳定表达,为研究副黏病毒Tianjin株NP蛋白功能与病毒致病性、宿主亲嗜性奠定了基础.     

热休克蛋白65及其融合蛋白Hsp65-6×P277的分离纯化和稳定性研究

来源于牛分枝杆菌的热休克蛋白65（Hsp65）在没有佐剂的情况下可作为载体分子将抗原表位递呈给免疫系统。热休克蛋白具有蛋白酶的催化活性，容易发生自溶而降解，这制约了基于Hsp65疫苗的研究。该研究中，建立了纯化Hsp65及其融合蛋白Hsp65-6×P277（P277为来源于人热休克蛋白60的肽段，线性重复6次）的方法。Hsp65与Hsp65—6×P277以可溶形式表达于大肠杆菌。在低温及添加EDTA的条件下经细胞裂解、硫酸铵沉淀及阴离子交换树脂等纯化方法，可得到电泳纯的目的蛋白。用纯化的融合蛋白Hsp65-6×P277免疫小鼠，可激发机体产生强烈的免疫应答，该融合蛋白有希望作为免佐剂的糖尿病疫苗加以进一步研究开发。     

鼻粘膜免疫融合蛋白Hsp65-6×p277预防NOD小鼠1型糖尿病的发生

目的提高多肽p277的免疫原性,从而提高其对自身免疫性糖尿病的预防作用.方法将p277 6次重复与Hsp 65融合置于pET28a中构建重组Hsp 65-6×p277表达质粒.该重组质粒在大肠杆菌BL21中以高效可溶形式表达.依次通过细胞裂解、硫酸铵沉淀、双蒸水透析、DEAE纤维素52柱层析纯化获得目的蛋白.用纯化后的融合蛋白Hsp 65-6×p277通过鼻腔给药方式,在不添加任何佐剂的情况下3次免疫4周龄雌性NOD小鼠.每月眼角取血,检测抗体和血糖浓度.结果初步药效学实验表明融合蛋白Hsp 65-6×p277可抑制NOD小鼠中1型糖尿病的发生.结论融合蛋白Hsp 65-6×p277有可能发展成为一种具有防治胰岛素依赖性糖尿病作用的疫苗.     

热休克蛋白65及其融合蛋白Hsp65-6×P277的分离纯化和稳定性研究

来源于牛分枝杆菌的热休克蛋白65(Hsp65)在没有佐剂的情况下可作为载体分子将抗原表位递呈给免疫系统。热休克蛋白具有蛋白酶的催化活性,容易发生自溶而降解,这制约了基于Hsp65疫苗的研究。该研究中,建立了纯化Hsp65及其融合蛋白Hsp65-6×P277(P277为来源于人热休克蛋白60的肽段,线性重复6次)的方法。Hsp65与Hsp65-6×P277以可溶形式表达于大肠杆菌。在低温及添加EDTA的条件下经细胞裂解、硫酸铵沉淀及阴离子交换树脂等纯化方法,可得到电泳纯的目的蛋白。用纯化的融合蛋白Hsp65-6×P277免疫小鼠,可激发机体产生强烈的免疫应答,该融合蛋白有希望作为免佐剂的糖尿病疫苗加以进一步研究开发。     

副粘病毒融合肽与麻疹病毒核蛋白的CTL表位连结物能掺入ISCOM并可诱导CTL应答

抗原掺入的免疫刺激复合物(ISCOM)可诱导机体产生高水平体液免疫和细胞免疫.本实验将亲水性麻疹病毒(MV)核蛋白(NP)的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位(NP29)与副粘病毒融合肽(F1)嵌合制成IS-COM,用以诱导CTL的溶细胞效应.首先合成代表WVNP281-290氨基酸序列的NP29和含位于NP29CTL表位羧基端融合蛋白序列的NP29-F1,进而制备IS-COM.用表达MVNP的腺病毒载体RAd 68腹腔注射BALB/c小鼠,5～6天后取脾,分离淋巴细胞.用NP29和NP29-F1体外刺激后,与靶细胞P815共同培育,证实NP29-F1与NP29体外诱导的溶靶细胞效应相同.将乳化于弗氏完全佐剂的NP29免疫BALB/c     

阻断CD40/CD40L相互作用延长移植物抗宿主病小鼠存活时间

目的：克隆表达人CD40-Ig融合蛋白，并在小鼠移植物抗宿主病（GVHD）模型中研究利用其阻断CD40/CD40L相互作用的保护性效果。方法：利用RT-PCR技术自人Daudi细胞系中克隆CD40基因胞外区，并插入含有人IgG1Fc段基因的pIG1载体中，构建携带CD40-Fc融合基因的瞬时表达载体转染COS-7细胞，间接夹心ELISA法检测CD40-Ig融合蛋白的表达，再将CD4-Fc融合基因连接入pcDNA3.1的相应位点构建稳定表达载体转染CHO细胞，筛选分泌CD40-Ig融合蛋白的阳性重组CHO细胞并进行无血清大规模培养，收获培养上清利用ProteinA亲和层析法纯化融合蛋白。SDS-PAGE，Western blot和配基结合实验鉴定CD40-Ig的性质，将C57BL6/J（H-2^b)小鼠的脾细胞经尾静脉注射入亚致死剂量照射的BALB/c(H-2^d)小鼠体内建立急性GVHD模型。通过体内注射CD40-Ig融合蛋白评价其对急性GVHD小鼠的保护效果。结果：按上述方法分别构建了哺乳动物表达载体pIG/40Ig和p3.1/40Ig。ELISA和Western blot确定在COS-7和CHO细胞中表达了CO40-Ig融合蛋白，SDS-PAGE结果显示该蛋白具有通过二硫键结合的二聚体结构并以同源二聚体的形式存在，纯化的CD40-Ig可与CD40L结合，体内应用CD40-Ig融合蛋白治疗可延缓小鼠GVHD病情发展并显著延长小鼠的平均存活时间。结论：CD40/CD40L相互作用在GVHD的病理过程中可能扮演了十分重要的角色，提示人CD40-Ig融合蛋白在临床预防和治疗GVHD方面的巨大应用潜力。     

MTS／P15和Bcl—2蛋白产物在鼻咽低分化鳞癌中的表达及意义

目的：观察抑癌基因MTS2／P15及凋亡抑制基因Bcl-2在低分化鼻咽癌（NPC）中的表达，探讨其与低分化NPC发生、发展和预后的关系。方法：用免疫组化SP法检测42例低分化NPC组织和17例无瘤鼻咽（NP）组织的P15、Bcl-2蛋白的表达情况。结果：低分NPC中P15、Bcl-2蛋白的阳性表达率分别为57．1％和83．3％，NP组织中P15蛋白表达率为100％，而Bcl-2蛋白大多在假复层纤毛柱状上皮的基底层细胞有表达，但较NPC细胞染色弱，而在鳞状上皮多为阴性，可认为Bcl-2蛋白在NP组织为阴性表达。P15及Bcl-2蛋白在NPC与NP组中表达比较、两者差异有统计学意义（P＜0．05）。P15与Bcl-2蛋白在NPC中表达与临床分期、颈淋巴 结转移、3年生存时间无关，其差异均无统计学意义（P＞0．05）。两蛋白阳性表达之间无相关性。结论P15蛋白在低分化NPC中表达缺失和Bcl-2蛋白在低分化NPC中的过度表达对NPC中的发生起一定作用。     

甲型流感病毒核蛋白基因的真核质粒的构建及其表达

目的构建甲型流感病毒MPR／8／34（H1N1）核蛋白（nucleoprotein,NP）基因的真核表达载体,转染Hela细胞,并用甲型流感病毒检测试剂盒（nuARapidTestKit）检测其表达情况。方法用特异引物从甲型流感病毒cDNA中采用PCR技术克隆出NP基因,将其插入到真核表达质粒pcDNA3．1（＋）。酶切、PCR、测序鉴定后,构建好的pcDNA3．1（＋）／NP用脂质体转染法转染到Hela细胞,通过甲型流感病毒检测试剂盒检测其蛋白表达。结果克隆出一个核苷酸长度为1432bp的基因。和A／PR／8／34（H1N1）（GenBank／NCB,GI：8486129）有98％的同源性,转染Hela细胞后用甲型流感病毒检测试剂盒检测到24h、48h、72h细胞内外的蛋白表达。结论成功构建甲型流感病毒A／PR／8／34（H1N1）核蛋白基因的真核表达质粒,为进一步研究理化因素对该基因的影响、基因的结构和功能打下良好的基础。     

裸DNA免疫诱导HCMV gB特异性中和抗体和pp65特异性CTL应答

作者构建了含人巨细胞病毒（HCMV）糖蛋白B（gB）或磷蛋白65（pp65）基因片段的表达质粒:pK-gB（含四环素控制成分的全长gB）、p△RC-gB（膜结合型全长gB）、p△RC-gB680（缺乏跨膜区的分泌型gB）和p△RC-pp65。将这些质粒分别注射雌性BALB/c小鼠四头肌,第4及第8周各加强免疫1次,每组10只小鼠。定期取血清作ELISA和微量中和试验或取脾细胞进行pp65特异性细胞毒性T细胞（CTL）试验以评价这些质粒的免疫原性。     

肾综合征出血热病毒结构蛋白致病作用的研究

用细胞免疫化学技术及免疫印迹法分别动态检查了肾综合征出血热病毒（HFRSV）膜蛋白（MP）和核蛋白（NP）在外周血单个核细胞（PBM）、尿融台细胞中的表达及尿液中的排出情况，分析其与病情和肾功能的相互关系。发现HFRS患者从入院起至病程两周末PBMC中均有MP和NP表达，尿液中亦有MP和NP排出，随着病情的好转，其表达逐渐减少，而MP之表达强度与病情及肾损较重呈平行关系。75％患者尿液中发现融合细胞，而融合细胞越多，肾损越重。83．3％融合细胞中可检出MP，但NP均为阴性。这些结果表明MP与HFRSV的致病作用相关，这也是HFRSV直接致病的佐证。     

减毒曼哥病毒:重组活疫苗的新载体

曼哥病毒基因组只有一个解读框架,它编码一种大的多聚蛋白,后者可分为三段,P1、P2和P3。病毒RNA基因组只在感染细胞的胞质中表达,它之所以能致病,完全是由其基因组5＇非编码区中聚C片段决定的,如果截去或缺失此片段,致病性随之丧失,因此易于得到稳定的减毒株。为了研究表达外源基因的重组曼哥病毒能否诱导保护性免疫力,作者用经过充分（钅监）定的淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（LCMV）核蛋白（NP）序列中一个细胞毒性T淋巴细胞（CTL）表位与曼哥病毒重组为VLCMG4病毒,免疫小鼠,观察其保护作用。     

治疗性双质粒HBV DNA疫苗的体外转染表达与鉴定

目的：探讨治疗性双质粒HBV DNA疫苗转染COS-7细胞后目的基因的表达情况。方法：以脂质体转染试剂Lipofectamine^TM 2000介导，将带有preS2＋S基因的重组疫苗质粒pS2，S和带有hIL2＋hIFNγ融合基因的重组佐剂质粒pFP分别转染COS-7细胞，同时设立空质粒转染和未转染细胞为对照组，于转染后24，48，72，96h采用EL／SA法检测细胞培养上清的HBsAg、融合蛋白白细胞介素（IL-2）及干扰素（IFN-1）的表达，并测定融合蛋白的IL-2、IFN-γ活性，采用ECL Western blotting分析和鉴定目的蛋白preS2＋S、IL-2及IFN-γ的分子质量大小。结果：双质粒在转染COS-7细胞后不同时间均可进行分泌表达。且48h时目的蛋白的表达量达峰值，其中表达的融合蛋白具有较高的IL-2和IFN-γ的生物学活性，pS2．S和pFP的转染上清分别在30．6ku和110ku处有特异性阳性反应条带。结论：HBVDNA疫苗质粒pS2．S和佐剂质粒pFP在COS-7细胞的最佳表达时间是转染后48h，并鉴定双质粒表达产物的分子质量大小分别为30．6ku和110ku。     

基于转录组学和蛋白质组学分析小檗碱抗糖尿病慢性炎症机制

目的:通过LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型,应用转录组学和蛋白质组学技术探究小檗碱抗糖尿病慢性炎症机制。方法:RAW264.7细胞通过LPS(0.1μg·mL^-1)诱导,给予小檗碱(1μg·mL^-1),分别提取蛋白和RNA,进行蛋白质组学和转录组学分析,分别找出差异表达蛋白和差异表达基因,并进行基因本体(GO)富集分析和京都基因与基因组百科全书(KEGG)通路富集分析,并运用STRING进行绘制相互作用图(PPI),对共同差异表达蛋白和基因进行实时荧光定量PCR进行验证。结果:通过模型组与小檗碱组相比较,转录组学共有1801个差异表达基因,找出11种差异表达基因Pdia4,Itgam,Hsp90b1,Prdx5,Pdia6,Myc,Fosl1,Il10,Ccl2,Lpin2,Pik3r2与炎症相关;蛋白质组学共得到83个差异表达蛋白,找出10个差异表达蛋白Hsp90b1,Pdia6,Prdx5,Pdia4,Itgam,Stat1,Pgm2,Ptgs1,Nos2,Actb与炎症相关;共同差异表达蛋白和基因共有5个。结论:小檗碱可能是通过减少炎症因子释放,同时减少Hsp90b1,Pdia6,Prdx5,Pdia4,Itgam,PTGS1,NOS2和IL^-10及增加Pik3r2和LPIN 2基因的生成来达到抗炎作用,进一步缓解异常代谢和胰岛素抵抗以及减轻内质网氧化损伤来治疗糖尿病。     

白藜芦醇对H2O2 及TGF-β2诱导人小梁网细胞的影响及机制探讨

摘要： 目的 观察过氧化氢 （H2O2 ） 及转化生长因子 （TGF） -β2 诱导人小梁网细胞 （HTMCs） 后对纤维连接蛋白（FN）、 胶原蛋白 1 型 （COL1）、 核因子 （NF） -κB P65 蛋白和白细胞介素 （IL） -1β基因表达的影响及白藜芦醇 （RSV） 的干预作用。方法 （1） 选取汇合度 70%～80%的 HTMCs 分为 5 组。实验组于无血清培养基中分别加入浓度为 150、 300、 450、 800 μmol/L 的 H2O2 处理, 对照组的培养基中不加 H2O2。Western blot 法检测各组 FN、 COL1、 NF-κB P65、 NF-κB P65 磷酸化 （P-NF-κB P65） 蛋白的表达, 实时定量 PCR 法检测 IL-1β基因的表达。（2） HTMCs 细胞分为 3 组。对照组以不含 H2O2 及 RSV 的无血清培基处理, H2O2 组以 300 μmol/L 的 H2O2 处理, H2O2+RSV 组同时加入 300 μmol/L 的 H2O2 及 25 μmol/L 的 RSV 处理。检测各组上述蛋白和基因的表达情况。免疫荧光检测各组 NF-κB P65 在 HTMCs 中的定位。（3） HTMCs 细胞分为 3 组。对照组以不含 TGF-β2 及 RSV 的无血清培基处理, TGF-β2 组以 5 μg/L 的 TGF-β2 处理, TGF-β2+RSV 组为同时加入 5 μg/L 的 TGF-β2 及 25 μmol/L 的 RSV 处理。检测各组上述蛋白和基因的表达情况。结果 （1） 与对照组比较, 150、 300、 450、 800 μmol/L 组 FN 和 P-NF-κB P65 蛋白表达水平均增高, 300、 450、 800 μmol/L 组 COL1 蛋白和 IL-1β基因表达水平增高 （P < 0.05）, 其他指标比较差异均无统计学意义。（2） H2O2 组较对照组 FN、 COL1、 P-NF-κB P65 蛋白和 IL-1β基因表达水平均增高, 而 H2O2+RSV 组较 H2O2 组上述指标均降低, H2O2+RSV 组较对照组仅 IL-1β降低 （P < 0.05）。对照组仅细胞质表达 NF-κB P65, H2O2 组细胞胞质及核中均有 NF-κB P65 表达, 且核中表达较多; H2O2+RSV 组细胞胞质中表达 NF-κB P65 较核中多。（3） TGF-β2 组较对照组 FN、 COL1、 P-NF-κB P65 的蛋白和 IL-1β基因水平表达均增高 （P < 0.05）, TGF-β2+RSV 组较 TGF-β2 组上述指标均降低 （P < 0.05）。 结论 H2O2 和 TGF-β2 能上调 HTMCs 的 FN、 COL1、 P-NF-κB P65 蛋白及 IL-1β基因的表达, 可能参与青光眼的发生发展过程。RSV 能抑制H2O2和 TGF-β2对HTMCs 的影响, 对青光眼发挥一定的保护作用。     

乙酰葛根素对氧糖剥离诱导海马神经元凋亡的影响

目的研究新型异黄酮类化合物乙酰葛根素对氧糖剥离神经元的保护作用及其机制。方法采用氧糖剥离建立细胞模型。DAPI法观察神经元凋亡率,RT-PCR法检测NF-κBp65、HIF-1α及p53mRNA的表达,Western blot法测定Hsp70蛋白的含量及乙酰葛根素对其的影响。结果与模型组相比较,乙酰葛根素可以减少凋亡细胞数;降低NF-κBp65、HIF-1α及p53mRNA表达;乙酰葛根素(低,中和高浓度组)增加Hsp70蛋白的表达。结论乙酰葛根素降低NF-κBp65、HIF-1α、p53的表达和升高Hsp70蛋白表达。     

人树突状细胞融合肝癌细胞体外诱导特异性抗肿瘤免疫

目的探讨人树突状细胞（DC）融合肝癌细胞（HCC）体外诱导T淋巴细胞产生特异性抗肝癌免疫的作用。方法应用人重组粒细胞／巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF）和重组人白细胞介素4（rhIL-4）对人外周血单个核细胞进行体外诱导产生树突状细胞,流式细胞仪检测DC表面标志物表达水平,聚乙二醇融合DC与肝癌细胞HerG2,MTT法测定融合细胞（HerG2／DC）刺激T淋巴细胞增生、分化能力,细胞毒性实验检测HerG2／DC诱导的细胞毒T淋巴细胞（CTL）对HerG2的特异性杀伤作用。结果融合细胞HerG2／DC刺激T淋巴细胞增值能力明显提高,HerG2／DC活化的CTL对HerG2具有明显的特异性杀伤作用。结论人树突状细胞融合肝癌细胞可有效诱导T淋巴细胞产生特异性的抗肝癌肿瘤免疫。     

编码配体-抗原融合体的DNA疫苗的定点免疫应答

作者以结合了淋巴结内皮小静脉 CD34的 L -选择蛋白 (Lsel)和结合了抗原提呈细胞 (APC) CD80和 CD86的 CTL A4作为配体 ,并以 CD5信号肽 (分泌必需 )为非定向对照 ,分别构建表达配体 -人免疫球蛋白 (h Ig)融合体的 Lsel- h Ig、CTL A4- h Ig和 CD5 L-h Ig质粒。分别将 1 0 0μg上述质粒于 0和 1 4天注射 6～ 8周龄雌性小鼠的股四头肌 ,用ELISA检测抗体 ,用51 Cr释放法检测细胞毒性 T淋巴细胞 (CTL)应答。研究显示 ,抗体和 CD4T细胞的应答均增强 ,且抗体产生速度加快。免后 2周 ,免疫 CTL A4- h Ig质粒的3种不同品系 H- …     

IL-13融合蛋白表达载体与非融合蛋白表达载体的构建与比较

采用RT－PCR技术直接从激活的健康人外周血单个核细胞中扩增得到hIL－13的基因片段，通过DNA重组技术分别将其插入到含有PRPL启动子的高效表达载体pBV220及含tac启动子、lac1阻遏蛋白基因及凝血酶识别位点的融合蛋白表达载体pGEX－4T－2中，成功地构建了hIL－13的原核非融含蛋白表达菌株hIL－13－PBV220／DHS5a及融合蛋白表达菌株hIL－13－PGEX－4T－2／TG1，分别经42℃热诱导及异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）化学诱导后，SDS－PAGE结果表明IL－13仅以GST融合蛋白的形式在E.coli中获得了表达，表达量约占菌体蛋白总量的10％～30％。IL-13的蛋白单体在原核细胞中表达量很低。     

Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白 ROP16的基因克隆表达及生物信息学分析

目的：构建弓形虫Chinese 1基因型TgCtWh3（以后均简称Wh3）株棒状体蛋白（ rhoptry protein ,ROPs）16的原核和真核重组表达质粒及其3D结构。方法参照ROP16序列分别设计引物,采用PCR从弓形虫Chinese 1基因型Wh3株基因组DNA中扩增出编码ROP16的基因片段,克隆至pMD18-T载体;经PCR及测序分析鉴定;阳性克隆的质粒分别亚克隆至原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2,分别转化大肠杆菌BL21和DH5α,PCR和酶切鉴定转化菌落插入的序列;将构建的原核表达菌株经IPTG诱导,SDS-PAGE和免疫印迹分析融合蛋白的表达;将构建的真核重组质粒经脂质体转染293T细胞,观察其在细胞中表达;采用生物信息学方法分析构建了蛋白的3 D结构。结果各组均PCR扩增出约2．1 kb ROP16基因的特异片段,序列检测结果均正确;分别亚克隆到原核表达载体pET-28a和真核表达载体pEGFP-C2中,成功构建了Chinese 1基因型弓形虫棒状体蛋白ROP16的原核表达质粒和真核表达质粒;原核表达质粒在大肠杆菌中表达了ROP16的融合蛋白;真核表达质粒在293T细胞中成功表达,成功构建出ROP16基因的3D结构图。结论以pET-28a和pEGFP-C2为载体,分别成功构建并表达了ROP16的原核和真核重组质粒,并构建出其3D结构图。     

治疗性结核菌苗

英国国立医学研究所（NIMR）和巴西圣保罗大学的科学家采用美国Vical公司的技术,研制治疗结核病（TB）的DNA疫苗,它不会引起结核杆菌耐药株。NIMR的Lowrie等将表达麻风杆菌热休克蛋白（Hsp）65、结核杆菌Hsp70或结核杆菌ESAT6抗原的质粒DNA序列插入巨细胞病毒（CMV）启动子载体,同时加入能提高抗原表达的、人CMV169株的第1内含子（IE-1）。