PPARγ表达上调抑制肝星状细胞增殖的实验研究

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）表达上调对肝星状细胞增殖及凋亡的影响。方法体外培养HSC—T6细胞至对数生长期,以不同浓度的PPARγ激动剂15d—PGJ2作用24h后应用RT—PCR的方法观察分析各组肝星状细胞PPARγmRNA的表达,MTT检测HSC增殖情况,流式细胞仪分析HSC—T6细胞凋亡情况。结果15d—PGJ2处理的HSC—T6细胞中PPARγmRNA表达比例上调;凋亡细胞数明显增多。不同浓度的15d—PGJ2均可抑制HSC—T6细胞的增殖,以2μmol／L组最为显著。结论PPARγ表达上调能够抑制HSC—T6增殖并诱导其凋亡。     

姜黄素通过激活过氧化物酶体增殖子活化受体γ诱导肝星状细胞凋亡

目的研究姜黄素对肝星状细胞(HSC)凋亡的作用,以及与过氧化物酶体增殖子活化受体γ(PPARγ)信号之间的关系。方法肝脏原位灌流酶消化、Nycodenz密度梯度离心方法分离培养大鼠HSC,传代培养并使用药物处理。Ho-echst33258染色检测细胞凋亡,免疫荧光染色检测PPARγ的细胞内分布。收集裂解细胞分别抽提RNA、总蛋白和核蛋白,半定量RT-PCR和Westernblot方法检测目标基因和蛋白表达水平。结果活化HSC几乎没有凋亡发生,而姜黄素处理诱导了HSC凋亡,促进了HSC中PPARγ的核转位和(或)重分布。姜黄素在转录和翻译水平,增强HSC胞核PPARγ表达,抑制了抗凋亡因子Bcl-2的表达,促进了促凋亡因子Bax表达;这些作用能够被PPARγ阻断剂所拮抗。结论姜黄素促进过氧化物酶体增殖因子活化受体γ表达和核转位/重分布,诱导肝星状细胞凋亡。     

15d-PGJ_2对肝星状细胞增殖和凋亡的影响

目的观察15d-PGJ2上调过氧化质体增殖物激活受体γ(PPARγ)表达以及对肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖凋亡的影响。方法体外培养HSC-T6细胞,取对数生长期的细胞,应用1、2、3μmol.L-1不同浓度的PPARγ激动剂15d-PGJ2作用24h,同时以不加药物只加无血清培养基做为对照组,24h后应用RT-PCR的方法观察分析各组间肝星状细胞PPARγ mRNA表达的变化,Western blot检测相应的胞质内NF-κB抑制蛋白表达。MTT检测HSC增殖,吖啶橙荧光染色观察细胞凋亡,流式细胞仪分析细胞周期。结果经15d-PGJ2处理的HSC细胞中PPARγ mRNA表达比例上调;胞质内NF-κB蛋白表达明显抑制。MTT结果显示不同浓度的15d-PGJ2对HSC-T6细胞的增殖均有抑制作用,以2μmol.L-1组最为明显;吖橙啶染色显示经PPARγ激动剂处理组凋亡细胞数明显增多,流式细胞仪结果显示15d-PGJ2处理组细胞产生了G1期阻滞作用。结论15d-PGJ2能够上调PPARγ表达并抑制HSC-T6增殖及诱导其凋亡,其诱导凋亡机制可能与抑制NF-κB活性有关。     

罗格列酮对类胰蛋白酶诱导的大鼠肝星状细胞Ⅰ型胶原及过氧化物酶体增殖物活化受体γ表达的影响

目的观察罗格列酮对类胰蛋白酶诱导的大鼠肝星状细胞(HSC)Ⅰ型胶原及过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)表达的影响,探讨罗格列酮抑制肝纤维化的作用机制。方法将大鼠HSC-T6进行体外培养,取对数生长期细胞分为空白对照组,1、10、100 ng/ml类胰蛋白酶组,10 ng/ml类胰蛋白酶+(5、10、20μmol/L)罗格列酮组。用半定量反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测HSCⅠ型胶原及PPARγ的表达。结果类胰蛋白酶可以诱导大鼠HSCⅠ型胶原表达并使HSC PPARγ表达减少(P<0.05),罗格列酮可以不同程度抑制类胰蛋白酶的上述效应,且各组Ⅰ型胶原的表达水平均低于10 ng/ml类胰蛋白酶组(P<0.05),各组PPARγ的表达水平均高于10 ng/ml类胰蛋白酶组(P<0.05),并呈剂量依赖性(P<0.05)。结论罗格列酮能够上调PPARγ表达并抑制类胰蛋白酶诱导的HSCⅠ型胶原的表达,抑制肝纤维化的发生。     

清热活血补益方影响肝脏胶原代谢的分子生物学机制

目的 :从分子生物学水平研究中药复方清热活血补益方 (肝纤方 )如何影响大鼠肝脏的胶原合成及降解。方法 :运用血清药理学方法制备中药含药血清 ,将之作用于从SD大鼠肝脏分离培养的肝星状细胞 ,并测定Ⅰ型胶原含量、Ⅰ型前胶原mRNA的表达和胶原酶活性。结果 :与对照组相比 ,含药血清组Ⅰ型胶原含量降低 ,Ⅰ型前胶原mRNA的表达受到抑制 ,胶原酶的活性增加 (P <0 .0 5 )。结论 :清热活血补益方通过抑制Ⅰ型前胶原mRNA的表达来减少胶原的合成 ,通过提高胶原酶的活性来促进胶原的降解 ,这可能是其多位点抗肝纤维化的部分分子生物学机制。     

类胰蛋白酶对肝星状细胞增殖及Ⅰ型胶原mRNA表达的影响

目的 观察类胰蛋白酶对肝星状细胞(HSC)增殖及I型胶原mRNA表达的影响,探讨类胰蛋白酶在肝纤维化中的作用.方法 用Percoll密度梯度离心法分离、培养大鼠HSC,经系列浓度类胰蛋白酶作用后,分组进行如下实验:用噻唑兰比色法(MTT)检测HSC的增殖:用RT-PCR法检测I型胶原mRNA的表达.结果 肥大细胞(MC)类胰蛋白酶(1～100ng/ml)能够促进HSC增殖及I型胶原mRNA的表达,此作用呈剂量依赖性(各实验组与对照组比较,P＜0.05).结论 肥大细胞类胰蛋白酶可直接作用于HSC,参与肝纤维化过程.     

化纤灵方药物血清对肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的:探讨化纤灵方药物血清对肝星状细胞(HSC)增殖及凋亡的影响.方法:传代培养的大鼠HSC系HSC-T6与中药复方化纤灵方药物血清(5%、10%、20%)共同培养48 h后,应用MTT法检测HSC-T6细胞增殖,琼脂糖凝胶电泳法及流式细胞仪测定细胞凋亡.结果:复方化纤灵方药物血清能显著抑制体外培养的HSC-T6增殖,中、高剂量组凋亡率分别为(20.37±0.78)%、(21.69±2.35)%、显著高于正常对照组(P<0.01);化纤灵方药物血清均可诱导HSC凋亡.结论:复方化纤灵方能抑制HSC增殖并促进其凋亡,可能是抗肝纤维化作用的主要机制.     

联苯双酯对大鼠肝星状细胞增殖和凋亡及PPARγ表达的影响

摘 要 目的： 探讨联苯双酯(dimethyl dicarboxylate biphenyl,DDB)对大鼠肝星状细胞HSC-T6增殖和凋亡及过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator-activated receptor gamma, PPARγ)表达的影响。方法: 接种HSC T6细胞于96孔板和6孔板中,分别用CCK 8法和流式细胞术测定不同浓度联苯双酯作用于细胞24 h后对细胞增殖和凋亡的影响;实时荧光定量PCR（Quantitative Real time PCR,Q-PCR）和Western blotting分别检测药物对HSC-T6细胞PPARγ mRNA和蛋白的表达的影响。结果: 相比于对照组（0 μmol·L^-1）,DDB在实验浓度（8～64 μmol·L^-1）能明显抑制HSC T6的增殖（P<0.05),促进HSC T6的凋亡（P<0.05);药物处理过的HSC T6细胞PPARγ mRNA及其蛋白表达均有显著提高。结论:DDB可通过上调HSC T6细胞中PPARγ的表达抑制细胞的增殖,促进细胞的凋亡。     

鬼针草总黄酮对肝纤维化大鼠肝星状细胞TGF-β1信号传导通路的影响

目的研究外源性转移生长因子-β1(transforming growth factor betal,TGF-β1)对肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的激活作用,观察鬼针草总黄酮(total flavonoids of Bidens Bipinnata L,TFB)对HSC中smad2/7和Ⅰ型胶原mRNA和蛋白表达的影响,以探讨TFB抗肝纤维化的作用及分子机制。方法采用Collagenase Ⅳ胶原酶原位肝灌注法分离HSC,MTT法观察TFB对TGF-β1刺激下HSC增殖的作用,ELISA法检测HSC自分泌TGF-β1和产生Ⅰ型胶原的影响;RT-PCR法观察分析TFB对TGF-β1刺激下HSC中smad2/7和Ⅰ型胶原基因表达的影响;Westernblot法观察TFB对TGF-β1刺激下HSC中smad2蛋白表达的影响。结果TGF-β1明显促进HSC增殖、自分泌TGF-β1和产生胶原,促进HSCsmad2、Ⅰ型胶原mRNA及smad2蛋白的表达,明显抑制smad7mRNA表达(P<0.05),TFB作用后,TGF-β1刺激的HSC中smads2mRNA、蛋白和Ⅰ型胶原mRNA表达受到抑制,smad7mRNA表达明显上调。结论TFB抗肝纤维化作用可能与其阻断HSCTGF-β1通路进而阻断HSC的活化、增殖有关。     

西红花酸对乙醛诱导的肝星状细胞增殖和胶原合成的影响

目的:探讨西红花酸(Crocetin)对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(Hepatic stellate cell,HSC)增殖和胶原合成的影响及其作用机制.方法:培养大鼠肝星状细胞HSC-T6,建立乙醛诱导的HSC纤维化模型;用不同浓度的西红花酸(10-6、10-7、10-8 mol/L)对乙醛刺激的HSC-T6进行处理,MTT法检测细胞增殖;羟脯氨酸测定检测HSC-T6胶原含量;流式细胞分析仪测定细胞凋亡;Western blot检测细胞ERK1/2、Bax、Bcl-2蛋白的表达;RT-PCR检测Ⅰ型、Ⅲ型胶原蛋白、间质胶原酶(MMP-2)、组织金属蛋白酶抑制因子-1(TIMP-1)的基因表达.结果:在一定浓度范围里,西红花酸能抑制乙醛引起的HSC增殖和胶原合成;西红花酸诱导乙醛刺激的HSC细胞凋亡;西红花酸能增加Bax蛋白表达,降低乙醛刺激升高的ERK1/2、Bcl-2蛋白表达;西红花酸能明显降低Ⅰ型、Ⅲ型胶原、TIMP-1的表达,提高MMP-2的表达.结论:西红花酸通过抑制乙醛诱导的HSC增殖和胶原合成以及促进活化的HSC凋亡起到抗肝纤维化作用,其机制可能与ERK信号传导通路和对基质金属蛋白酶的调节有关.     

cAMP-PKA-CREB信号通路在大鼠酒精性肝纤维化星状细胞模型中的作用

目的探讨cAMP-PKA-CREB信号通路在大鼠酒精性肝纤维化星状细胞模型中的作用。方法采用不同浓度乙醛不同时间间隔干预肝星状细胞(HSC),建立体外酒精性肝纤维化星状细胞模型;采用MTT法检测HSC增殖,确定造模浓度及时间;RT-PCR法检测HSC活化指标α-SMA mRNA表达情况;125I-cAMP放射免疫分析方法测定正常组与模型组HSC内cAMP含量;RT-PCR法测定PKA,CREB mRNA表达情况。结果采用浓度为200μmol.L-1乙醛刺激HSC 48 h可建立酒精性肝纤维化星状细胞模型;模型组α-SMA mRNA表达较正常组明显增强,模型组cAMP含量较正常组显著增加;PKA,CREB mRNA表达也较正常组明显增强。结论乙醛可刺激HSC增殖活化,其机制可能与其激活HSC cAMP-PKA-CREB信号通路有关。     

过氧化物酶体增殖物活化受体γ在大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纤维化形成中的作用

目的研究大鼠非酒精性脂肪性肝炎(NASH)肝纤维化形成过程中肝组织核因子过氧化物酶体增殖物活化受体γ(PPARγ)的表达变化及意义。方法建立脂肪性肝纤维化大鼠模型,HE和Massson染色观察肝组织病理学变化,RT-PCR和免疫组织化学检测核转录因子PPARγ以及反映肝星状细胞(HSC)活化的特异性标记α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的mRNA和蛋白表达变化。结果①模型组大鼠8w肝脏病理学呈现单纯性脂肪肝,12-16w呈现脂肪性肝炎,24w呈现脂肪性肝纤维化的病理学变化特点。②RT-PCR显示模型组PPARγ mRNA于高脂喂养8w即明显上调为0.84±0.07,对照组为0.54±0.12,P<0.05.12w达高峰为1.16±0.14,16w脂肪性肝炎明显时表达开始下调为0.73±0.05,24w下调更为明显为0.34±0.15,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.05);而α-SMA mRNA于高脂喂养12w开始增高,24w达高峰,与对照组比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。③免疫组织化学显示模型组PPARγ主要在脂肪变性的肝细胞核表达增高,在肝纤维化形成部位其阳性染色明显减少,而α-SMA阳性细胞主要在纤维间隔、汇管区等纤维形成区域表达增多。结论单纯性脂肪肝时,PPARγ的高表达可能是机体的一种适应性反应,随着高脂诱导的肝损伤程度的加重,PPARγ的表达逐渐降低与肝星状细胞的激活密切相关,从而促进脂肪性肝纤维化的发生、发展。     

黄芪总苷对肝星状细胞增殖和合成胶原的抑制作用

目的　探讨黄芪总苷 (AST)对肝星状细胞增殖和合成胶原的影响。方法　采用枯细胞条件培养基 (KCCM )及含新生牛血清 (NBS)和健康大鼠血清 (RS)的混合血清刺激大鼠肝星状细胞 (HSC)系HSC T6 ,用 3H TdR和3H 脯氨酸参入法检测HSC增殖活性和胶原合成状况。结果　AST(1 6、32、64、1 2 8和 2 56mg·L- 1 )对KCCM 1∶4刺激HSC T6细胞增殖和胶原合成均有明显的抑制作用 ;在含 1 0 %NBS- 3 %RS混合血清刺激的HSC T6细胞 ,AST(32、64、1 2 8和 2 56mg·L- 1 )作用 48h对HSC T6细胞增殖 ,及AST(1 6、32、64、1 2 8和 2 56mg·L- 1 )作用 72h对HSC T6细胞胶原合成均有明显的抑制作用 ,呈浓度依赖型趋势。结论　AST对体外激活肝星状细胞的增殖和产生胶原有明显抑制作用 ,该作用可能是AST抗肝纤维化的机制之一     

红景天苷对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞增殖及胶原基因表达的影响

目的探讨红景天苷对乙醛刺激的大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)增殖、α1(I)型胶原mRNA合成、IκB和NF-κB表达的影响。方法用原位杂交、免疫细胞化学和凝胶电泳迁移率技术(EMSA)检测HSC的增殖和胶原基因表达。结果乙醛刺激HSC增殖、α1(I)型胶原mRNA合成 ,使IκB表达下降、NF-κB活性增加。红景天苷(0.5～2.5 mg·mL^-1)对上述影响有抑制作用,且以1.5 mg·mL^-1组效果最好。结论红景天苷明显抑制乙醛刺激的HSC增殖及胶原基因的表达。     

鬼针草总黄酮对肝纤维化大鼠治疗作用及机制探讨

目的观察鬼针草总黄酮(total flavones of bidens bip-innata L,TFB)对肝纤维化大鼠的治疗作用及机制。方法采用CCl4诱导大鼠肝纤维化模型,观察TFB对肝纤维化大鼠血清中HA、PCⅢ、CⅣ,肝组织中Hyp含量和肝脏病理组织学及肝组织中胶原增生程度的影响。同时采用α-SMA和TUNEL双重染色观察TFB对肝纤维化大鼠肝星状细胞(he-patic stellate cells,HSC)凋亡的影响。另体外分离培养HSC,MTT法观察TFB对HSC增殖的影响,电镜和流式细胞术法观察TFB对HSC凋亡的影响。结果TFB能降低肝纤维化大鼠血清中HA、PCⅢ、CIV和肝组织中Hyp含量,改善其肝脏病理损伤程度,减少肝纤维化大鼠肝组织中胶原的增生,抑制HSC的活化、增殖,促进活化的HSC凋亡。结论TFB对肝纤维化大鼠有很好的治疗作用,其抑制HSC活化、增殖,促进活化的HSC凋亡可能是TFB治疗肝纤维化的重要机制之一。     

吲哚-3-原醇对猪血清诱导大鼠肝纤维化的治疗作用

研究吲哚-3-原醇(I3C)对猪血清诱导大鼠肝纤维化的治疗作用及其机制。腹腔注射猪血清制备大鼠肝纤维化模型,造模成功后用I3C治疗17天。采用HE和Masson三色染色法分别观察肝脏病理学和胶原含量改变;生化比色法测定肝组织羟脯氨酸(Hyp)含量;免疫组织化学法观察肝脏中α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达。进一步培养大鼠肝星状细胞株HSC-T6,用13C处理24 h后,FITC-Annexin V/PI双重染色法检测细胞凋亡;实时荧光定量PCR法检测细胞凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的mRNA表达。结果显示,与模型对照组比较,各I3C治疗组的肝组织Hyp含量不同程度降低,肝细胞损伤减轻,胶原纤维沉积减少(P<0.01),α-SMA表达降低(P<0.01)。细胞实验显示,I3C可明显增加HSC-T6细胞凋亡率,升高Bax/Bcl-2的mRNA表达(P<0.05)。以上结果说明,I3C对猪血清诱导大鼠肝纤维化有一定治疗作用,可能与其诱导活化HSC凋亡继而促进基质胶原降解有关。     

肝宁方含药血清对人肝星状细胞增殖及凋亡的影响

目的研究肝宁方含药血清对人肝星状细胞(HSC-LX2)增殖及凋亡的影响。方法40只SD大鼠随机分为4组,每组10只,空白对照组与TGF-β1组SD大鼠给予生理盐水灌胃,TGF-β1+肝宁方组及肝宁方组SD大鼠给予肝宁方灌胃给药(7mL·kg^-1·d^-1),连续灌胃10d后取血离心,制备干燥血清粉末备用。将HSC-LX2分为空白对照组、TGF-β1组、TGF-β1+肝宁方组及肝宁方组。根据分组加入相应的20%大鼠血清对HSC-LX2进行培养造模。CCK8检测各组HSC-LX2细胞增殖率;流式细胞术检测各组HSC-LX2细胞的周期和细胞凋亡;qRT-PCR以及Western blotting分别检测各组α-SMA、Samd2、Samd3、Samd4、Samd7 mRNA及蛋白的表达。结果CCK8结果显示,TGF-β1+肝宁方组及肝宁方组HSC-LX2增殖受到抑制;流式细胞术结果显示,TGF-β1+肝宁方组及肝宁方组HSC-LX2周期停滞在G0/G1期并能促进细胞凋亡;qRT-PCR及Western blotting结果显示,TGF-β1+肝宁方组及肝宁方组α-SMA、Samd2、Samd3、Samd4 mRNA及蛋白的表达受到抑制,Samd7 mRNA及蛋白的表达增强。结论肝宁方具有抑制HSC-LX2增殖、促进HSC-LX2凋亡的作用,其作用与调控TGF-β1/Samd信号通路相关。     

益肝康及其拆方对肝星状细胞活化增殖及胶原代谢影响的研究

目的 探讨中药复方益肝康抗肝纤维化的作用机制及药效学配伍意义.方法 水蒸醇提法制备益肝康及其拆方-丹参小复方(丹参、黄芪、归尾)纯化浸膏.温育体外培养的肝星状细胞(HSC),3H-胸腺嘧啶核苷酸(3H-TdR)掺入法检测细胞增殖,免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)表达,3H-脯氨酸(3H-Pm)掺入法检测HSC胶原合成.结果 益肝康及丹参小复方对HSC的3H-TdR掺入、α-SMA表达及3H-Pro掺入均有显著抑制作用,对3H-TdR掺入抑制作用全方与拆方差异无统计学意义,而α-SMA表达及3H-Pro掺入的抑制作用全方优于拆方.结论 益肝康及丹参小复方可抑制肝星状细胞活化增殖及胶原合成,全方作用优于拆方.     

细脚拟青霉多糖对肝星状细胞体外活化的影响

目的探讨细脚拟青霉多糖(PtPs)对原代分离培养的新生大鼠肝星状细胞(HSC)活化的影响。方法将不同浓度的PtPs作用于新生大鼠的HSC,反转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HSC中转化生长因子β1(TGF-β1)mRNA和白介素10(IL-10)mRNA的表达,细胞免疫组织化学检测在不同培养时间HSC中α-平滑肌肌动蛋白(SMA-α)、细胞角蛋白18(CK-18)和Ⅰ型胶原的表达,检测单胺氧化酶(MAO)在HSC的培养上清和线粒体中的活性,检测羟脯氨酸(Hyp)在HSC的培养上清和胞浆中的含量。结果与对照组比较,各浓度PtPs组TGF-β1mRNA的表达均显著增加(P<0.01),IL-10mRNA的表达均显著下降(P<0.01);随着HSC培养时间的延长,PtPs各组较对照组CK-18的表达下降,SMA-α和Ⅰ型胶原的表达增强;与对照组比较PtPs 250 mg/L组培养上清和线粒体中的MAO活性最高(P<0.01),PtPs 62.5 mg/L组胞浆中Hyp含量最高(P<0.05)。结论PtPs能促进新生大鼠HSC体外活化。     

川芎嗪与阿米洛利联用对肝星状细胞增殖及分泌细胞外基质的影响

目的探讨钠氢交换抑制剂阿米洛利（Amiloride）与抗氧化剂川芎嗪联用对大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）增殖及分泌细胞外基质的影响。方法用不同浓度的阿米洛利和川芎嗪处理大鼠肝星状细胞；以MTT比色法测定细胞的增殖；放射免疫法测定透明质酸和层黏连蛋白；酶联免疫吸附法（ELISA）测定Ⅰ型胶原水平。结果阿米洛利和川芎嗪均可剂量依赖性地抑制HSC增殖，不同程度抑制Ⅰ型胶原、透明质酸和层黏连蛋白分泌，联用组优于单用组。结论作用于HSC不同靶点的抗纤维化药物联用优于单用。