采用改进的表示PCR技术分离胃癌差异表达基因及其临床意义

建立优化的差示ＰＣＲ条件：运用建立的条件分离胃癌ＧＣ７９０１与胃粘膜ＧＥＳ－１细胞株之间的差异表达基因；根据获取的序列，设计引物并运用于检测胃癌组织、血活检胃粘膜标本，拟筛选出检出率与符合率高的数对引物，建立胃癌基因诊断方法。方法：以ＧＣ７９０１与ＧＥＳ－１细胞株为研究对象，探索ｍＲＮＡ差示ＰＣＲ 最佳反应条件，运用优化的条件分离细胞株之间的差异表达基因；以回收的片段作条件分离细胞打点杂交证实为真     

人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901/VCR中的表达

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体,经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,并检测ｂａｘ基因在转导株的表达．方法：采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ＣＭＶ的多克隆位点之间,以脂质体介导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ,Ｇ４１８筛选克隆细胞,Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达．结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ,将之转入细胞后,经Ｇ４１８筛选３０ｄ获得了稳定的细胞克隆,即ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ－ｂａｘｃｅｌｓ．Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹证实了ｂａｘ基因转导株具有明显的Ｂａｘ蛋白表达．结论：ｂａｘ真核表达载体的构建,为胃癌耐药的临床治疗打下了基础．     

人脑胶质细胞来源神经营养因子基因的克隆及测序

为研究人脑胶质细胞来源的神经营养因子（ｇｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ ｄｅｒｉｖｅｄ ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ ｆａｃｔｏｒ, ＧＤＮＦ） 在神经系统疾病中的作用,根据ＧＤＮＦ 的ｃＤＮＡ 序列设计并合成引物,以流产胎儿脑组织为来源,分别提取ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 作模板,经ＲＴ ＰＣＲ 和ＰＣＲ 技术扩增人ＧＤＮＦ 基因片段,采用ＤＮＡ 重组技术将其克隆于ｐＧＥＭ Ｔ Ｅａｓｙ 载体中并测序。结果：ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 体外扩增得到的片段均是４１０ ｂｐ ,两者无差异。ＰＧＥＭ ＧＤＮＦ 经酶切鉴定正确,测序结果与Ｇｅｎｅｂａｎｋ 比较基本相同。由于ＲＮＡ 和基因组ＤＮＡ 扩增得到的片段大小相同,证实该基因片段内无内含子插入,该片段可用于真核及原核表达。     

人bax真核表达载体的构建及其在人胃癌耐药细胞系SGC7901／V …

目的：构建人ｂａｘ真核表达载体，经脂质体导入人胃癌耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，并检测ｂａｘ基因在转导株的表达。方法 采用分子克隆技术将ｂａｘ基因插入真核表达载体ｐＢＫ－ｃｍｖ的多克隆位点之间，以脂质体倡导法将目的基因导入受体细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ，Ｇ４１８筛选克隆细胞，Ｗｅｓｔｅｎ ｂｌｏｔ检测ｂａｘ基因的表达。结果：成功地构建了重组质粒ｐＢＫ－ｂａｘ，将之转入细胞后，经Ｇ４１８筛选３０ｄ     

C—myc在正常人外周血淋巴细胞及肿瘤细胞株上的表达

探讨癌基因Ｃ－ｍｙｃ在正常人外周血淋巴细胞及肿瘤细胞株上的表达情况。方法：分离正常人外周血淋巴细胞及肿瘤细胞株ＲＮＡ,利用反转录聚合酶链反应技术,比较正常人与肿瘤细胞株Ｃ－ｍｙｃ ｍＲＮＡ表达程度。结果：ＨＬ－６０细胞系Ｃ－ｍｙｃＲＮＡ表达最强,ＧＢＣ胃癌细胞株较正常人为高。结论：Ｃ－ｍｙｃ参与了正常、异常细胞生长的调节。     

人GDNF基因的克隆

克隆可表达人胶质细胞源性神经营养因子的基因。方法；从脑胶质细胞瘤患术后的脑瘤组织中提取总ＲＮＡ，以ＲＴ－ＰＣＲ方法扩增出了一般约５５８ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，将这一片段克隆于ｐＵＣ１８载体中，进行全序列分析。结果：证实该研究所克隆的ｃＤＮＡ是编码正确的ＧＤＮＦ基因。     

用荧光差异显示法分离新的肝细胞癌相关基因

目的：寻找新的肝细胞癌（ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ ｃａｒｃｉｎｏｍａ,ＨＣＣ）相关基因。方法：应用荧光－差异显示（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉｓｐｌａｙ）技术分析人ＨＣＣ、配对非癌肝、胎肝、正常肝等组织之间的基因差异表达,差异表达ｃＤＮＡ片段,经测序后,再用ＲＮＡ狭缝杂交对部分差异片段在上述４种组织中的表达进行验证。结果：共得到差异表达ｃＤＮＡ片段１１０条。经狭缝杂交     

信号分子GRF的PH结构域基因片段的克隆与表达

目的：从大鼠脾脏克隆信号分子ｇｕａｎｉｎｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ－ｒｅｌｅａｓｉｎｇ ｆａｃｔｏｒ（ＧＦＲ）的ｐｌｅｃｋｓｔｒｉｎ ｂｏｍｏｌｏｇｙ（ＰＨ）结构域基因并进行谷胱甘肽转移酶（ＧＳＴ）融合表达,为进一步寻找其新配基、研究其功能打下基础。方法：采用一步法从大鼠新鲜脾组织中提取总ＲＮＡ,反转录合成ｃＮＤＡ,ＰＣＲ方法扩增目的基因片段,并克隆到载体ｐＵＣ１９中。引物末端标记后,以双脱氧终止法     

双诱导模式原核表达系统的建立与应用

将ｙＧ－ＣＳＦ ｃＤＮＡ片段克隆于Ｔ７噬菌体ＲＮＡ聚合酶启动子系统的表达载体ｐＪＧＷ１中，并与可热诱导Ｔ７ＲＮＡ聚合酶产生的质粒ｐＧＰ１－２共同转化大肠杆菌ＤＨ５α，经化学诱导或温度诱导，ｈＧ－ＣＳＦ重组蛋白表达率〉３０％，并具有特异的生物活性。     

急性白血病细胞p53,C—Myc基因表达

采用＾３Ｈ－ｄＡＴＰ标记基因探针，ＤＮＡ－ＲＮＡ斑要交及免疫组化技术分析急性白血病细胞中ｐ５３，Ｃ－Ｍｙｃ基因的ＲＮＡ水平表达。结果：４０例白血病组织中３４例Ｃ－Ｍｙｃ ＲＮＡ表达水平升高，粒，淋白知病细胞之间无显著差异。     

胃癌差异表达基因的克隆测序及临床应用

目的 筛选数个在胃癌及癌前病变中检出率高的胃癌差异表达片段。方法 以筛选了的gcys-10,gcys-12,gcys-13,gcys-16这4个新基因片段为研究对象，将它们克隆入T载体中进行测序，根据序列设计引物，采用RT－PCR方法检测胃癌细胞株GC7901、胃粘膜细胞株GES－1以及胃癌、胃粘膜活检标本。结果 4个差异基因表达片段测序后经过同源性检索均为新基因，被基因库收录，收录呈为AF054171，AF071052，071053,某某071056。根据这些基因设计的4对引物均能从GC7901总RNA中扩增出相应产物，而gcys-10的引物未能从GES－1细胞株中扩增出相应产物。gcys-10在50例活检标本中的检出率分别为：萎缩性胃炎83.3%，肠腺化生81.8%，疣状胃炎58.3%，胃癌88.9%，胃溃疡50.0%，十二指肠溃疡0，急性胃炎0。在17例胃癌手术标本的检出率为94.1%。结论gcys-10,gcys-12,gcys-13,gcys-16均为胃癌差异表达基因，其中gcys-10在胃癌及胃癌前病变中检出率非常高，其表达的变化可能对胃癌的早期发展有意义。     

miRNA-101在胃癌组织和细胞中的表达及对胃癌生物学行为的影响

目的:探讨miRNA-101在胃癌组织和细胞中的表达情况及对胃癌细胞生物学行为的影响.方法:应用实时荧光定量PCR法分析31例胃癌组织和癌旁组织样本以及人胃癌细胞系SGC-7901、MKN45、人正常胃黏膜上皮细胞系GES1中miRNA-101的表达水平;建立miRNA-101重组腺病毒载体感染胃癌细胞系SGC-7901、MKN45,对照组为感染阴性对照病毒的胃癌细胞系SGC-7901、MKN45,MTT法检测miRNA-101对胃癌细胞增殖能力的影响;Transwell小室法检测胃癌细胞的迁移和侵袭能力.结果:胃癌组织中miR-101表达水平明显低于癌旁组织(P<0.01);miR-101在细胞系SGC-7901和MKN45中的表达量明显低于人正常胃黏膜上皮细胞系GES1(P<0.01).孵育48 h后MKN45细胞miRNA-101组的细胞增殖能力低于其对照组(P<0.05);而孵育72 h后SGC-7901细胞和MKN45细胞的miRNA-101组细胞增殖能力均亦低于相应对照组(P<0.05).迁移试验结果显示,miRNA-101组迁移的胃癌细胞SGC-7901和MKN45的平均细胞数明显低于相应对照组(P<0.01);侵袭实验结果显示,miRNA-101组侵袭的胃癌细胞SGC-7901和MKN45的平均细胞数亦明显低于其对照组(P<0.01).结论:miRNA-101在胃癌组织和胃癌细胞系中表达下调,转染miRNA-101可明显降低SGC-7901和MKN45细胞的增殖、迁移、侵袭能力,miRNA-101可能参与了胃癌疾病的发生及发展.     

Id1真核表达载体的构建及胃黏膜上皮细胞系的转染

目的: 扩增Id1基因,构建Id1真核表达载体pcDNA3.1/V5HisA-Id1. 方法: 以胃癌细胞SGC7901cDNA为模板,以Id1基因编码区外的两段特异性序列为引物,获得Id1基因的全长. 将目的基因插入载体pUCm-T,经序列测定证实后,亚克隆至pcDNA3.1/V5HisA并经酶切鉴定. 采用脂质体转染的方法将重组质粒稳定转染至胃粘膜上皮永生化细胞系GES-1中. 结果: 经RT-PCR方法扩增出大小为608 bp的基因片断,序列测定其编码序列及读框正确. 亚克隆经酶切鉴定正确. 经过8 wk G418筛选后,获得稳定表达Id1的细胞亚系. 经Western blotting 证实,Id1蛋白表达水平高于对照组. 结论: 成功地构建了Id1真核表达载体,为进一步研究其在胃癌细胞中的作用奠定了基础.     

TIMP-2拮抗胃癌SGC-7901细胞侵袭能力实验研究

目的 探讨基质金属蛋白酶抑制剂－２（ＴＩＭＰ－２）对ＳＧＣ－７９０１胃癌细胞体外侵袭能力的影响。方法 将人全长ＴＩＭＰ－２基因经脂质包裹转染ＰＡ３１７细胞系,Ｇ４１８筛选,感染人ＳＣＧ－７９０１胃癌细胞系,经体外细胞和电泳率、软琼脂形成和侵袭能力均明显低于对照组,而与对照组相比细胞增殖曲线没有明显的变化。结论 ＴＩＭＰ－２基因转染可以肿瘤细胞的表面电荷发生变化,使细胞的电泳能力、细胞的移动性和侵袭     

Hsa_circ_0001947对胃癌细胞增殖和凋亡的影响

［摘要］目的: 探讨环状RNA hsa_circ_0001947(circ_0001947)在胃腺癌细胞和组织中的表达及其对胃癌细胞增殖和凋亡的影响。方法: 通过高通量测序筛选出5例临床胃腺癌、癌旁组织标本中差异表达的5种环状RNA,挑选升高表达最明显的circ_0001947继续研究。实时荧光定量PCR检测circ_0001947在75例临床胃腺癌、癌旁组织以及胃癌BGC-823,HGC-27,MGC-803,SGC-7901细胞株、正常人胃黏膜上皮GES-1细胞株中的表达。将细胞株BGC 823、SGC 7901各分为两组,设si circ_0001947组(转染si RNA)和si NC组(转染无关序列)。细胞培养0、12、24、48、72 h后,采用CCK 8实验测定细胞活力。采用克隆形成实验测定细胞增殖能力;流式细胞术测定细胞凋亡率,蛋白印迹测定凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3,Bcl-2和Bax表达水平。结果： 高通量测序筛选出的胃腺癌组织中差异表达的环状RNA为hsa_circ_0000033,hsa_circ_0000038,hsa_circ_0004916,hsa_circ_0058092,hsa_circ_0001947。circ_0001947在胃腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P<0.01),在胃癌BGC-823,HGC-27,MGC-803,SGC-7901细胞株中表达量明显高于正常胃黏膜上皮GES-1细胞株(P均<0.05)。si RNA能够明显抑制BGC 823、SGC-7901细胞中circ_0001947表达。si-circ_0001947组BGC 823,SGC-7901细胞光密度值明显低于si-NC组(P均<0.01);si circ_0001947组BGC 823,SGC-7901细胞克隆形成率和细胞凋亡率明显低于si NC组(P均<0.01)。与si-NC组相比,si-circ_0001947组BGC 823,SGC 7901细胞中Cleaved caspase-3 及Bax表达明显上调,Bcl 2表达明显下调(P均<0.05)。结论： circ_0001947在胃癌细胞和组织中呈高表达,干扰circ_0001947表达可抑制胃癌细胞增殖并诱导其凋亡。     

人胃癌中Survivin基因的克隆及其剪切体的发现

目的：克隆人类抗凋亡基因survivin(SVV)。方法：提取胃癌细胞系SGC－7901总RNA，RT－PCR扩增人SVV全长cDNA，测序鉴定、原核表达。结果：得到两个SVV基因cDNA克隆，即SVV－S4A与SVV－S1B，前者与已知SVV基因cDNA序列相同，后者第3个外显子丢失。原核表达所获融合蛋白经SDS－PAGE电泳与已知SVV基因的蛋白质表达产物大小相近。结论：自人胃癌细胞中克隆出SVV基因的全长cDNA，并获得一个新的剪切体，实现了SVV基因在大肠杆菌BL21（DE3）中的高效表达。     

miRNA-34a 对人胃癌 SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响

目的：研究 microRNA-34a(mir-34a)在人胃癌细胞中的表达水平及对胃癌 SGC-7901细胞增殖、凋亡的影响。方法通过实时定量 PCR(RT-PCR)检测人正常胃黏膜上皮细胞 GES 及人胃癌细胞株 AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823中 mir-34a 的表达水平。体外将表达人 mir-34a ( has-mir-34a)慢病毒感染人胃癌 SGC-7901细胞。荧光显微镜观察评估细胞感染情况,MTT 实验、流式细胞术检测感染后胃癌SGC-7901细胞的增殖、细胞周期及凋亡情况。结果胃癌细胞 AGS、SGC-7901、MKN-45、BGC-823中 mir-34a 的表达水平较正常胃黏膜上皮细胞 GES 明显降低,其中以胃癌 SGC-7901细胞降低最为明显(P <0．01)。与阴性对照组相比, mir-34a 感染组 SGC-7901细胞增殖明显减慢( P <0．01), G1/ G0期细胞比例显著增加(P <0．05),细胞凋亡率显著升高(P <0．01)。结论 mir-34a 在多种人胃癌细胞,尤其是SGC-7901细胞中呈低表达。 mir-34a 可以抑制胃癌 SGC7901细胞的增殖,诱导细胞周期停滞及细胞凋亡。     

LncRNA-MEG3 对胃癌生物学特性 及铂类化疗敏感性的研究

目的 探讨LncRNA-MEG3 对胃癌增殖、凋亡及顺铂化疗敏感性的影响。方法 以人正 常胃黏膜上皮细胞GES1 作为对照细胞,实时荧光定量聚合酶链反应（qRT-PCR）检测胃癌MKN28、 SGC7901、AGS 及BGC823 细胞中LncRNA-MEG3 的表达;将过表达MEG3 的质粒转染BGC823 细胞作为 pcDNA3.1-MEG3 组,转染空白质粒的阴性对照作为pcDNA3.1 组,同时设置Control 组;将BGC823 细胞 分为pcDNA3.1 组、pcDNA3.1-MEG3 组、顺铂组及pcDNA3.1-MEG3+ 顺铂组。qRT-PCR 检测转染48 h 后细胞中LncRNA-MEG3 的表达;pcDNA3.1-MEG3、顺铂单独或共同处理BGC823 细胞,细胞计数试剂 盒法及流式细胞仪分别检测细胞活力及凋亡率;Western blotting 检测STAT3、磷酸化的信号转导与转录因 子3（p-STAT3）、Cyclin D1 和Bcl-2 的表达。结果 胃癌细胞中LncRNA-MEG3 的表达均低于GES1 细胞 （P <0.05）;4 组LncRNA-MEG3 相对表达量比较,差异有统计学意义（P <0.05）;pcDNA3.1-MEG3 组和顺 铂组Cyclin D1、Bcl-2 及p-STAT3 的蛋白表达低于pcDNA3.1 组（P <0.05）,细胞凋亡率高于pcDNA3.1 组 （P <0.05）。结论 胃癌细胞中LncRNA-MEG3 表达降低,过表达LncRNA-MEG3 可降低胃癌细胞活力并诱 导细胞凋亡,增加顺铂的化疗敏感性,其机制与下调STAT3 信号通路有关。     

嵌合锚定T细胞致癌胚抗原阳性胃癌细胞的凋亡效应

目的探讨CEA靶向性嵌合锚定T细胞的制备方法,并检测其活化功能及诱导CEA阳性胃癌细胞的杀伤活性。方法分离外周血单个核细胞（PBMC）,然后用免疫磁珠分离得到CD8^＋T细胞。将重组真核表达载体抗-CEA-scFv-CD3 zeta-pcDNA3．0采用脂质体转染上述T细胞以制备CEA靶向性的嵌合锚定T细胞;用流式细胞仪检测其CD69的表达,以检测嵌合锚定T细胞活化功能;将嵌合锚定T细胞与胃癌细胞HGC-27、SGC-7901共培养,检测后者膜联蛋白V的表达,分析嵌合锚定T细胞致胃癌细胞的凋亡效应。结果将已制备的CEA靶向性嵌合锚定T细胞培养12h、24h后,检测T细胞的活化信号CD69表达率分别为40．5％±3．4％、48．3％±2．8％,证明嵌合锚定T细胞具备活化功能。检测与嵌合锚定T细胞共培养的胃癌细胞HGC-27、SGC-7901,凋亡率分别为47．8％±4．2％、18．7％±2．8％,两者之间有统计学意义（P〈0．05）。结论CEA靶向性嵌合锚定T细胞可特异性识别CEA阳性胃癌细胞并促使后者凋亡,这种治疗策略将为胃癌的临床诊治提供一种有希单的涂释。     

胃癌组织和SGC-7901细胞中nucleostemin基因表达的实验研究

目的检测nucleostemin(NS)基因在胃癌组织和胃癌SGC-7901细胞中的表达情况。方法21例胃癌手术标本,提取胃癌组织和胃癌SGC-7901细胞株总RNA,用半定量RT-PCR方法检测胃癌组织和SGC-7901中NS基因的表达情况。用脂质体法将PCDNA4/C-NS-silencer质粒及空载体PCDNA4/C-vector质粒分别转染SGC-7901细胞,分别命名为silencer组和vector组,未转染的SGC-7901细胞记为normal组,RT-PCR方法检测NS基因表达量。用MTT法检测3组细胞的生长增殖情况。结果胃癌组织和SGC-7901细胞中皆有NS基因表达。定性分析显示,与vector组和normal组比较,silencer组细胞趋于分化,NS基因表达量下降。细胞培养24 h、48 h、72 h后,si-lencer组和vector组细胞增殖抑制率间差别均有统计学意义(P<0.01)。结论胃癌组织和SGC-7901细胞中有NS基因表达;NS基因特异性RNA干扰使NS基因表达量下降,抑制SGC-7901细胞株体外增殖。