铜绿假单胞菌外膜蛋白H原核表达、多克隆抗体制备及免疫保护作用

目的 为绿脓杆菌外膜蛋白OprH工业发酵、蛋白功能与疫苗开发研究奠定基础。方法 通过分子克隆获得OprH蛋白的表达菌株。利用切胶纯化获得OprH蛋白免疫小鼠,制备OprH蛋白多克隆抗体,采用ELISA法检测抗体滴度,Western-Blotting法检测抗血清特异性;并对小鼠免疫OprH蛋白,攻毒绿脓杆菌,检测蛋白的免疫保护作用。此外,通过正交试验,获得OprH菌株的最佳表达条件与培养条件。结果 OprH重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果,以及蛋白表达、纯化条带大小与预测一致。ELISA法获得OprH抗血清滴度达1:1600倍,Western-Blotting试验证实抗血清具有很好的特异性。OprH免疫小鼠激活的特异性免疫,对小鼠绿脓杆菌感染的保护率达到46.15 %,与对照相比较具有显著差异。OprH菌株最佳诱导表达条件为：加IPTG终浓度0.3 mmol/L,诱导时菌液OD600值0.8,温度32℃,诱导时间3 h;最佳培养条件为：转速230 r/min,葡萄糖浓度0％,装液量50 mL。结论 成功构建OprH表达载体,纯化获得OprH蛋白,制备OprH蛋白多克隆抗体,确定OprH蛋白对小鼠绿脓杆菌感染具有显著地免疫保护作用,并获得OprH蛋白菌株的最佳表达条件与培养条件。     

铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF原核表达载体的构建及表达

目的 克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF基因,构建原核表达载体并鉴定表达。方法 从铜绿假单胞菌中提取基因组DNA,PCR扩增OprF羧基端,克隆至原核表达载体pET28b中,构建重组表达载体pET28b-F。重组质粒经酶切和序列测定后,转化E.coli BL21,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,进行SDS-PAGE检测。经Ni-NTA亲和层析柱纯化后OprF蛋白免疫BALB/C小鼠,通过杂交瘤方法制备相应单克隆抗体并用ELISA方法进行鉴定。结果 pET28b-F原核表达载体构建成功。重组表达质粒经IPTG诱导后表达外膜蛋白OprF。获得4株高分泌型特异性单克隆细胞株,其中2株单克隆抗体可用于制备双抗体夹心法ELISA试剂盒,检测铜绿假单胞菌。结论 成功克隆铜绿假单胞菌外膜蛋白OprF羧基端基因片段并在大肠杆菌中进行表达,筛选出特异性抗OprF单克隆抗体。     

抗炭疽毒素保护性抗原单克隆抗体的制备及功能分析

目的:原核表达炭疽杆菌保护性抗原PA10蛋白,制备单克隆抗体,并进行功能分析?方法:人工合成炭疽杆菌保护性抗原PA10编码基因并克隆入pUC57载体,酶切鉴定后,将PA10编码基因插入原核表达载体pColdⅡ中,测序验证正确后转化至大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG和低温条件下诱导蛋白表达,SDS-PAGE验证产物;用HiTrap IMAC HP柱纯化重组蛋白,Western blot进一步验证?以纯化获得PA10重组蛋白为抗原,常规程序免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,并检测所制备抗体的中和活性?结果:获得的PA10重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,最终获得了4株特异性的单克隆抗体(分别命名为2G8?5A8?7B3? 9C9)?经体外炭疽毒素保护试验证实,其中1株单抗(7B3)具有较强的中和活性,其保护率可高达96%?结论:本文成功构建并表达炭疽杆菌保护性抗原PA10,制备了具有中和活性的抗PA单克隆抗体,为构建人源化的抗PA中和抗体奠定基础,从而有望用于炭疽病的治疗?     

艰难梭菌二元毒素B的克隆及其免疫原性分析

目的将艰难梭菌二元毒素B(cdtB)克隆到pET-28b载体,探索重组His-CdtB蛋白可溶性表达的最佳条件并纯化相应蛋白,分析其免疫原性。方法为了分析艰难梭菌二元毒素B的免疫原性,先以艰难梭菌标准菌株ATCC BAA-1870为模板,PCR扩增cdtB全长基因序列,克隆到质粒pET-28b,转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞以构建pET-28b-cdtB的原核表达载体,诱导E.coli-pET-28b-cdtB大量表达可溶性重组His-CdtB蛋白并利用镍柱亲和层析法纯化,纯化后的His-CdtB蛋白免疫Balb/c小鼠,分析小鼠血清抗体抗CdtB滴度。结果成功构建了pET-28bcdtB原核表达载体,目的蛋白为可溶性表达的最近诱导条件是培养温度为25℃、IPTG浓度为1.5 mmol/L、160 r/min振荡增菌12 h,最佳纯化条件为20 mmol/L的咪唑洗脱杂蛋白后用200 mmol/L的咪唑洗脱目的蛋白,纯化后的HisCdtB蛋白经质谱鉴定成功,该蛋白免疫Balb/c小鼠后产生的抗CdtB抗体滴度达到1∶105。结论纯化后的HisCdtB重组蛋白免疫Balb/c小鼠后产生了高效价抗CdtB抗体,说明其具有免疫原性,为今后进一步进行二元毒素B的诊断及疫苗等研究奠定了实验基础。     

OX40基因原核表达及优化

目的 构建小鼠OX40胞外段基因的原核表达载体,进行诱导表达并优化表达条件.方法 PCR扩增OX40胞外段基因并将其插入原核表达质粒pET32a(+),重组pET32a-OX40经测序鉴定后转入表达菌株BL21(DE3)进行融合蛋白的小量诱导表达,并优化表达条件.结果 出现新增蛋白条带,融合蛋白主要存在于包涵体中;Western Blotting分析表明该融合蛋白可与相应抗体发生特异性结合.结论 构建了小鼠OX40基因的原核表达载体,获得OX40胞外段融合蛋白的最佳表达条件,为后续单抗制备等工作奠定了基础.     

细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉抗原重组蛋白的表达、纯化及免疫学鉴定

目的对细粒棘球蚴中国大陆株亲肌肉基因(myophilin)的重组质粒进行原核表达、纯化,并初步鉴定重组蛋白的免疫学特性,为重组疫苗研制的后续工作提供依据。方法对已构建的基因工程菌株myophilin/pGEM-T/JM109进行酶切,获取目的基因。将目的基因亚克隆于表达载体pET28a构建基因工程菌株,筛选阳性表达菌株并进行诱导表达、经SDS-PAGE鉴定重组myophilin蛋白。以纯化的myophilin做抗原免疫小鼠,用Western blot、ELISA对该蛋白的免疫原性及免疫鼠血清抗体水平进行检测。结果成功构建含原核重组表达载体myophilin/PET28a/BL21,并纯化出浓度较高的重组蛋白;ELISA检测显示,用表达、纯化的重组蛋白免疫小鼠,诱导产生了一定水平的血清抗体;实验组血清与对照组血清抗体含量差异有统计学意义(P<0.05)。结论纯化后的重组蛋白myophilin具有较强的免疫原性,有望作为包虫病候选疫苗进一步研究。     

肺炎链球菌表面黏附素A的原核表达及免疫保护性研究

目的 利用基因工程技术获取原核表达的肺炎链球菌表面黏附素A(Psa A)蛋白并初步研究其对小鼠的免疫保护性.方法 根据基因库中psa基因序列设计合成特异性引物,从临床分离到的肺炎链球菌中提取DNA,PCR技术扩增目的 基因psaA,克隆后构建原核表达栽体PET-32a(+)/psaA,将重组质粒转化到大肠杆茵BL21(DE3)中,以IPTG诱导表达,获得重组蛋白,并通过Western-blot鉴定其免疫活性.将重组蛋白免疫小鼠,观察对肺炎链球茵感染动物的保护作用.结果 经酶切及测序鉴定,克隆出870bp的目的 基因,DNA序列与Gen-Bank中的相应数据符合率为100%;成功构建出原核表达载体pET-32a/psaA;经IPTG诱导,表达出了约57 kD左右的融合蛋白,与预期大小相符,并且具有抗体结合活性;重组PsaA蛋白对肺炎链球菌感染小鼠具有一定保护作用.结论 在原核细胞中成功表达出PsaA蛋白,能在一定程度上抵抗肺炎链球菌感染,为基于黏附素的新型疫苗的研究提供线索.     

铜绿假单胞菌多表位核酸疫苗的构建及其生物学作用的研究

目的:构建铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,PA)多表位-MyD88基因疫苗并对其免疫原性进行研究。方法:将PA外膜蛋白F(OprF)的三个中和性B细胞表位及一个外源通用T细胞表位串联,采用重叠PCR方法合成DNA,并在此序列前插入组织型纤溶酶原(tPA)的信号肽基因,将此获得的片段与MyD88基因分别克隆入pIRES载体构建重组质粒pIRES-tPA-OprF:MyD88,并将该质粒免疫Balb/c小鼠,采用ELISA法测定特异性抗体水平。气管内接种PA,进行肺组织匀浆PA细菌计数。结果:成功构建真核表达质粒pIRES-tPA-OprF:MyD88,用该质粒免疫小鼠,能刺激机体产生高度特异性抗体,气管接种PA后,免疫组小鼠肺匀浆细菌计数明显低于其他对照组。结论:成功构建了重组有MyD88基因的PA表位核酸疫苗,接种小鼠后可诱导特异性免疫应答,产生较好的抗铜绿假单胞菌感染的免疫保护作用。     

人血管内皮生长因子A(VEGFA)的原核载体构建、蛋白表达及鉴定

目的 克隆人VEGFA基因,与原核载体融合表达、纯化及其鉴定,并将其应用于肿瘤血管生长研究过程中.方法 采用PCR方法扩增人VEGFA序列,将其克隆入pGEX-KG原核载体,获得pGEX-KG-hVEGFA重组质粒.将该质粒转化入E.coli菌株BL21 (DE3),经IPTG诱导其表达,以GSTrap亲和层析柱纯化融合蛋白,采用SDS-PAGE电泳,Western Blot方法鉴定融合蛋白的表达.结果 PCR扩增获得了hVEGFA基因片段,经测序证实与GenBank公布的序列一致,重组的质粒载体经过PCR、酶切鉴定,证明重组质粒中已成功的插入了hVEGFA基因片段.成功构建了该蛋白的原核表达载体pGEX-KG-hVEGFA.结论 融合蛋白在IPTG终浓度为0.5 mmol/L、25℃条件下诱导表达,并获得纯化融合蛋白.采用Western Blot的方法可检测到目的融合蛋白GST-hVEGFA的表达.     

小鼠精子蛋白Sp17的克隆、表达及其免疫原性研究

目的 获得鼠精子蛋白Sp17基因,构建重组表达载体并实现其在大肠杆菌中的高效表达,为制备免疫性避孕疫苗奠定基础.方法 提取BALB/c小鼠睾丸组织总RNA,通过RT-PCR扩增Sp17基因全长cDNA序列,并将其克隆至pMD 18-T质粒载体中,再经HindⅢ/ XhoⅠ双酶切将Sp17基因片段亚克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,转化大肠杆菌BL21(DE3),异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达,采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)、Western blot对表达产物进行初步鉴定,并检测重组蛋白Sp17免疫小鼠后血清特异抗体滴度.结果 获得了小鼠Sp17的全长cDNA,成功构建了重组原核表达载体pET/Sp17,在IPTG的诱导下实现了目的蛋白在大肠杆菌中的高效表达,免疫后小鼠血清中检测到特异性抗体.结论 小鼠精子蛋白Sp17基因序列已被克隆至原核表达载体pET-28a(+)中,并在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效、正确的表达,重组蛋白Sp17能够诱导产生特异性免疫反应,具有一定程度的免疫原性.     

经络腧穴理论的形成与发展

从<脉书·十一脉><黄帝内经>等文献人手,梳理了血气、经络、腧穴理论的形成与发展,简要介绍了四肢部的基本腧穴、躯体部要穴,以及腧穴配伍的基本要义.     

载脂蛋白的结构和功能与病毒病的预防和治疗

载脂蛋白（apo）是脂蛋白的重要组成成分,其主要功能是调节酶活性,介导细胞受体与脂蛋白结合,保持脂蛋白结构的稳定性。目前已发现数十种载脂蛋白,其结构的显著特点是分子中具有多个双性alpha螺旋及Beta-折叠结构。载脂蛋白的这种双性alpha螺旋结构是其结合及转运脂质的结构基础。在HIV外壳结构中的一种糖蛋白（gP）也具有这种alpha螺旋结构。近年研究表明,载脂蛋白和由载脂蛋白组成的脂质体还具有抗肝炎病毒、抗HIV病毒、抗单纯疱疹和中和细菌内毒素的功能。以脂蛋白和载脂蛋白为主要成分构成的脂质体已成为运载抗病毒和抗肿瘤药物受体的靶向性载体。     

神经病学与神经解剖学优化整合的评价与分析

目的评价神经病学与神经解剖学优化整合教学法的教学效果,寻找存在的问题及解决对策,为今后的神经病学教学改革提供参考。方法采用问卷调查、访谈的方式,分析神经病学教改后的教学效果、对学生学习态度的影响、教学中存在的不足。结果教改班的教学效果、对学生学习态度的改善优于非教改班(P<0.01)。结论神经病学与神经解剖学优化整合的教学改革效果显著,达到了预期的目的。     

析议痰瘀同源、互结、同治

目的:探讨痰瘀相关,意在梳理痰瘀知识、并强调痰瘀相关的重要性。方法:通过多角度地分析、刍议"痰瘀同源"、"痰瘀互结"、"痰瘀同治"等痰瘀经典理论的方式论述痰瘀相关。结果:痰与瘀是中医界里重要的元素,痰与瘀互结是许多疾患共同的病机,痰瘀同治是常用治法。结论:痰瘀同源、互结、同治,不但在临床上有着实用的指导意义,又能与时俱进、在探究中创新。     

卵巢子宫内膜样癌的CT、MRI诊断与病理分析

目的：探讨卵巢子宫内膜样癌（OEC）的CT、MRI表现及病理基础。方法：回顾性分析经手术病理证实的8例OEC的CT、MRI表现,并与手术和组织病理学结果进行对照分析。结果：8例OEC位于左侧5例,右侧3例。肿瘤最大径4．5～17．5cm,平均9．2cm。全部肿瘤均呈囊实性,6例形态不规则呈分叶状,2例呈圆形或卵圆形。肿瘤边界部分模糊7例,清楚1例。CT平扫：肿瘤实性成分cT值37～46Hu,平均4lHu,囊性成分cT值14～40Hu,平均25Hu;增强后肿瘤实性成分呈中等程度强化,动脉期cT值6l～77HIJ,平均66Hu,实质期cT值65～78HU,平均71HU。MR平扫：T2wI实性成分呈等信号,囊性成分呈低信号,T2wI实性成分呈稍高信号,囊性成分呈高信号,增强后肿瘤实性成分中等程度强化。8例OEC中合并子宫体内膜癌2例,其中l例经MRI检查,表现为子宫体部内膜不规则增厚,T2wI呈等信号,TnwI呈稍高信号,增强后呈中等程度强化,1例合并同侧卵巢巧克力囊肿。结论：CT、MRI能较好地反映OEC的病理特征,清晰显示肿瘤的形态、内部结构及邻近结构侵犯等情况,具有重要的定性价值,并为临床选择合理治疗方案提供依据。     

“医信融创”教育模式的构建与实践探索

从必要性、要求及实质3个角度梳理了“医信融创”教育的内涵,并在此基础上探索“医信融创”教育的模式。“医信融创”需要遵循由“融”到“创”的逻辑主线,通过“融行-融智-融心”的过程最后走向“创新”的目的。最后以山西医科大学的实践案例证明了“医信融创”教育的必然性和可行性。     

瘿病源流简析

以先秦两汉、隋唐、宋金元、明清四个时期,将瘿病的发展总结为理论奠基期、方药汇集期、方药充实期和应用发展期。通过对中国历代医学文献中有关瘿病内容的梳理,追溯有关瘿病理、法、方、药认识的历史,厘清前人对瘿病在不同历史时期的表述特点,以及前人对这一疾病认识的发展脉络,为现今中医药防治瘿病提供理论依据和启示。     

新生儿游泳对生长发育的影响研究

目的:探讨新生儿游泳的护理以及对生长发育的影响。方法:按照知情同意制度,选取125例实施游泳的新生儿为观察组,随机选取同期未游泳的新生儿为对照组(125例)。观察两组新生儿出生后42d头围、生长和体重的变化,比较两组生后7d、15d和28d的24h摄乳量。结果:42d后游泳组的婴儿头围、生长、体重增长明显,特别是体重增幅较大,两组统计学有明显差异;游泳组摄乳量从第7天开始均高于对照组,出生后28d更是明显增多,有显著统计学意义。结论:游泳有利于新生儿增加摄乳量,促进新生儿体格发育。     

教考合一与教考分离的统一——医学基础课综合性考试模式初探

考试是检验教学效果的有效方法,是教学过程中不可缺少的环节。多年来,人们对考试改革不断进行探索,总结出不同的考试模式,例如教考合一与教考分离就是2种完全不同的考试模式。通过对比2种考试模式的优势与劣势,提出适合医学基础课的综合性考试模式。     

中国脊柱关节炎和强直性脊柱炎的规范监测和研究展望

脊柱关节炎和强直性脊柱炎是风湿病中青壮年致残率较高的常见疾病之一,近年来在定义、分类、诊断和治疗方面不断更新,但是,达标治疗还缺乏有效的策略.围绕近年研究热点,本文结合作者研究团队的我国脊柱关节炎和强直性脊柱炎的研究结果进行论述,以期为今后该类疾病的探索性基础和临床研究方向提供线索.