大鼠肝星状细胞简便分离法及鉴定

目的：介绍一种简便、经济、稳定的大鼠肝星状细胞（hepatic stellate cell,HSC）分离方法,为肝纤维化的研究提供细胞模型。方法：取符合标准的雄性SD大鼠,体重约400-450g,行肝脏门静脉插管,灌洗肝脏后,先后采用链酶蛋白酶、Ⅳ型胶原酶、DNA酶I灌注,消化肝脏制成细胞悬液,20％Nycodenz密度梯度离心分离得到原代HSC。Desmin及α—SMA抗体免疫组化鉴定纯度。结果：HSC得率2×10^7／每肝,细胞存活率及纯度达95％以上。结论：该法简便、经济,细胞得率和纯度稳定,是一种实用的大鼠HSC分离方法。     

Optiprep法分离大鼠肝星状细胞的实验研究

目的：建立一种合理、经济、便捷的大鼠原代肝星状细胞（hepatic stellate cells,HSC）分离方法。方法：运用改良肝脏原位灌注D-Hanks后,改用Ⅳ型胶原酶和DNA酶Ⅰ离体灌注,10%、16%Optiprep密度梯度离心分离大鼠肝星状细胞,台盼蓝排斥试验鉴定细胞活力,α-SMA免疫细胞化学法鉴定细胞纯度。结果：我们采用Optiprep密度梯度离心法成功分离出大鼠HSC,且活力、纯度均达到研究要求,HSC得率约为2×107/肝,细胞存活率为95%以上,纯度为90%以上。结论：本方法分离大鼠HSC合理、经济、便捷。     

大鼠肝星状细胞分离与培养方法的实验研究

目的：探讨一种经济易行的分离与培养大鼠肝星状细胞的方法,为研究肝纤维化的发病机制提供良好条件。方法：采用离体循环酶液灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经两种密度的Nycodenze密度梯度液高速离心（20000r/min）和细胞悬液低速离心（40×g）去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,desmin和GFAP免疫细胞化学双抗单染色法鉴定肝星状细胞的纯度。结果：肝星状细胞的得率为（3.6±0.1）×10^7/肝,肝星状细胞存活率为（92.8±0.8）%,对培养24h的肝星状细胞行desmin和GFAP共同鉴定DAB显色,细胞阳性率为（96.2±0.5）%。结论：本改良法在保证大鼠肝星状细胞产量的前提下提高了细胞纯度,有利于对原代大鼠肝星状细胞及肝纤维化的进一步研究。     

大鼠肝星状细胞和枯否细胞的分离与培养方法

目的建立一种可以同时分离大鼠肝星状细胞(HSC)和枯否细胞(KC)的方法。方法选用SD大鼠,经胶原酶和蛋白酶灌注肝脏后,用18%Nycodenz密度梯度离心,分离大鼠HSC和KC,HSC处在界面,KC处在界面下。常规台盼蓝染色行细胞活力鉴定;荧光显微镜下观察自发荧光确定HSC的纯度;KC免疫细胞化学检测。结果成功分离大鼠肝星状细胞和枯否细胞,HSC得率为2×107/肝,KC得率为(3~6)×106/肝,活性>90%,纯度>90%。结论该方法建立的HSC和KC同时分离培养的方法,简单、易行、可靠,细胞纯度高,同时获得的细胞可保持良好的生物学性状。     

一种简便经济的肝星状细胞分离方法

目的　介绍一种简易、经济、高产的肝星状细胞 (HSC)分离方法 ,为肝纤维化的研究提供细胞模型。方法　参照国内外方法加以改良 ,应用D hanks液校正淋巴细胞分离液 ,使其为 1 0 53 ,采用单层一步梯度离心法分离HSC。结果　细胞获得量为 (3 5± 0 5)× 1 0 7/只 ,存活率、纯度均在 95 %以上。结论　本方法简便、实用、高产 ,不需特殊设备 ,便于推广应用     

大鼠肝星状细胞的简易分离法

目的在肝脏二步酶灌注法分离大鼠肝星状细胞的基础上,探讨一种简单易行且结果稳定的分离方法。方法采用大鼠肝脏二步酶灌注法对成年大鼠的肝脏进行消化,经密度梯度离心去杂质后得到肝星状细胞。台盼蓝拒染实验鉴定细胞活率,结蛋白(Desmin)免疫荧光鉴定肝星状细胞的纯度。结果肝星状细胞的得率为4.0×107以上,肝星状细胞纯度为96%左右,肝星状细胞存活率为(95.0±1.2)%。结论本实验采用的大鼠肝星状细胞的分离方法,结果稳定,细胞纯度较高,有利于进一步的生物学研究。     

肝星形细胞的分离与培养

目的 :分离培养大鼠肝星形细胞 ,为深入研究肝纤维化的发生机制奠定基础。方法 :采用IV型胶原酶、链酶蛋白酶消化肝脏 ,密度梯度离心分离HSC ,台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率 ,Desmin免疫细胞化学法鉴定HSC纯度。结果 :每只成年大鼠肝脏的HSC得率为 (2 33± 0 1 5)× 1 0 7个 ,细胞存活率在 95 %以上。免疫细胞化学显示 ,desmin阳性细胞为 (90 3± 2 8) % ,传代培养后阳性细胞在 98%以上。结论 :建立了稳定、高产的HSC分离方法 ,细胞得率、活率、纯度方面达到了国内外文献报道的水平     

改良法大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定

目的:改良大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cells,HSC)的分离培养及鉴定方法,使之简便易行,高效可靠.方法:采用肝离体胶原酶灌注消化,低速离心去除肝细胞,密度梯度离心法分离HSC,采用台盼蓝染色排斥法鉴定细胞活率,desmin加GFAP免疫细胞化学双染色法鉴定HSC纯度.结果:采用改良法,每只大鼠的HSC得率为(2.54±0.13)×107个,细胞活率为(98.8±0.7)%,高于旧方法的HSC得率[(2.18±0.18)×107个,P＜0.01]和活率(94.3±0.6)%,P＜0.01].用desmin加GFAP免疫细胞化学双染色法鉴定,HSC纯度为(96.8±1.0)%,高于单用desmin鉴定的纯度(91.8±2.2)%(P＜0.01).结论:改良的大鼠HSC分离培养方法简便易行又经济,在保证纯度的同时,提高了得率和活率.采用desmin加GFAP免疫细胞化学双染色法鉴定细胞纯度,提高了鉴定的敏感性.     

分离、鉴定与培养大鼠肝细胞、肝星状细胞和Kupffer细胞

目的：建立稳定的同时分离原代大鼠肝细胞（HC）、肝星状细胞（HSC）和Kupffer细胞（KC）的方法,并初步评估其在体外培养的特征。方法：通过胶原酶原位灌注获得肝脏单细胞悬液,随后行等密度离心结合选择性贴壁纯化肝脏原代细胞,细胞的产量和活力经自动细胞计数仪计算出,纯度经免疫荧光、特殊染色及吞噬等实验进行鉴定。结果：大鼠原代HC产量为（21.0±8.2）×106/g肝组织,活力为92.1%±2.1%,纯度为96.5%±2.2%;原代HSC产量为（2.5±0.8）×106/g肝组织,活力为90.1%±3.8%,纯度为93.1%±1.5%;原代KC产量为（4.1±1.2）×106/g肝组织,活力为96.2%±2.7%,纯度为95.1%±1.4%。分离的HC、HSC和KC适合体外长期培养。HSC在体外培养过程中失去维生素A,逐渐向成纤维细胞表型转变。KC在体外可增殖,至14 d时仍表达CD68,具有较强的吞噬能力。结论：成功建立同时分离和培养大鼠HC、HSC和KC的方法,为进一步研究肝脏病理生理提供细胞基础。     

大鼠肝星状细胞的分离培养及鉴定

目的　研究肝损伤后细胞基质的沉积及纤维化形成机制 ,建立一套经济、简便、可靠的分离大鼠肝星状细胞的方法。方法　采用胶原酶、链霉蛋白酶循环灌流法分离大鼠的肝星状细胞 ,18%Nycodenz密度梯度离心纯化肝星状细胞 ,采用免疫组织化学方法鉴定Desmin阳性细胞的纯度。结果　每只鼠肝约获取 3 .6× 10 7个星状细胞 ,活率、纯度平均为 95 .4%、95 %。结论　本方法建立了有效的大鼠肝星状细胞的分离和培养方法。     

脐血造血干细胞分离方法的比较

目的：探讨分离脐血造血干细胞的最佳方法。方法：采用Ｆｉｃｏｌ分层法、３％明胶自然沉降法及６％羟乙基淀粉自然沉降法。结果：３％明胶自然沉降法所获有核细胞（ＮＣ）密度高达９４．６０（±２３．８０）×１０５／ｍｌ,ＣＦＵＧＭ数为６４．３０（±１２．１８）／１０５ＮＣ,ＣＤ３４＋细胞数为１．２１（±０．３７）×１０５／ｍｌ,均较其它两种方法为高（Ｐ＜０．０５）。结论：３％明胶自然沉降法是一种较理想的分离脐血造血干细胞的方法。     

保肝中药复方对肝星形细胞组织金属蛋白酶抑制剂表达及凋亡的干预

目的观察保肝中药复方药物血清对传代肝星形细胞组织金属蛋白酶抑制剂(TIMP-1)表达及凋亡的影响,以探讨其抗肝纤维化的作用靶点.方法采用大鼠肝星形细胞分离培养,免疫组化ABC法检测肝星形细胞TIMP-1表达与药物血清的干预,经图像分析定量;Giemsa染色和TUNEL染色计算凋亡细胞百分比.结果药物血清组的肝星形细胞TIMP-1阳性反应物吸光度与对照组比P＜0.05;细胞凋亡率为10.3%.结论保肝中药复方药物血清能抑制肝星形细胞TIMP-1的表达,并促进活化的肝星形细胞凋亡.     

益气活血方药抑制大鼠HSC体外增殖作用的实验研究

目的　研究益气活血方药抑制大鼠肝星状细胞 (HSC)体外增殖的作用机理和有效部位群。方法　用脂多糖 (lipopolysccharide ,LPS)刺激体外培养的HSC增殖 ,同时加入不同时相的含药血清Scl、Sc2或正常鼠血清 (Sn)或该方药不同提取物 ,分别培养 2 4、4 8、72h ,MTT法测定细胞增殖率 ,流式细胞仪测定HSC凋亡率。结果　在培养各时相Sc1和Sc2对LPS刺激的HSC增殖都有明显的抑制作用 (P <0 0 5或P <0 0 1)。流式细胞仪测定HSC凋亡的结果显示Sc2明显促进了HSC的凋亡 (P <0 0 1)。该方药不同提取物以不同的模式抑制体外培养的大鼠HSC增殖。结论　益气活血方药含药血清具有抑制体外培养大鼠HSC增殖作用 ,并促进其凋亡 ;益气活血方药有不同的有效部位群 ,并以不同的模式发挥作用     

Effects of Kupffer cells stimulated by triglyceride and very low-density lipoprotein on proliferation of rat hepatic stellate cells

ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｅｃｔｓｏｆｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ,ｖｅｒｙｌｏｗｄｅｎｓｉｔｙｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ（ＶＬＤＬ）,ａｎｄＫｕｐｆｅｒｃｅｌｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍ（ＫＣＣＭ）ｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｔｒｉｇｌ...     

人PBMC和脐血CD34~+细胞诱导DC2的实验方法研究

目的:探讨从人外周血单个核细胞(PBMC)和脐血CD34+造血干细胞(HSC)诱导DC2方法。方法:分别用rhIL-3(10ng/ml)+rhG-CSF(100ng/ml)和rhFlt-3L(100ng/ml)+rhIL-3(10ng/ml)+rhG-CSF(100ng/ml)诱导人PBMC和脐血CD34+HSC向DC2分化,并采用流式细胞仪分析细胞的表型,同时观察rhTNF-α和人CD40单抗诱导DC2分化成熟的作用。结果:rhG-CSFh+rhIL-3未能较好地从PBMC中诱导出DC2,但是从富集的脐血CD34+HSC用rhFlt-3L+rhIL-3+rhG-CSF诱导,可以获得相对较多的DC2,并有较高的扩增效率,但离临床研究和应用还有一定距离,因此DC2的诱导方法仍需进一步优化。人CD40单抗和rhTNF-α一样,能有效地诱导DC2分化成熟。结论:体外联合多种细胞因子从CD34+HSC成功地诱导出DC2,抗人CD40单抗有利于DC2的活化成熟。     

肝星状细胞经趋化因子SDF-1/CXCR4轴途径促进肝癌细胞侵袭的作用及其机制

目的：探讨肝星状细胞（HSC）通过SDF-1/CXCR4轴对肝癌细胞侵袭的影响和可能机制,为研究肝癌的侵袭过程提供依据。方法: 采用Western blotting和RT-PCR检测HSC LX02和肝癌细胞MHCC97、SMMC7721、Hep3B、HepG2中SDF-1和CXCR4的表达。采用Transwell实验检测LX02共培养或外源性SDF-1干预对肝癌细胞HepG2以及CXCR4基因沉默后的HepG2侵袭的影响。Western blotting法检测上皮标志E-Cadherin和间质标志Vimentin的表达水平。结果：与肝癌细胞比较,LX02中趋化因子SDF-1呈高表达（P<0.05）。4株人肝细胞癌细胞均有CXCR4高表达。HSC或SDF-1均能促进肝癌细胞HepG2侵袭（P<0.05）,并诱导E-Cadeherin蛋白表达下调,Vimentin蛋白表达上调。通过RNA干扰技术靶向沉默肝癌细胞CXCR4基因后,HSC和SDF-1对肝癌细胞HepG2侵袭能力均无明显影响（P>0.05）,肝癌细胞E-Cadeherin、Vimentin蛋白及mRNA表达水平亦无明显变化。结论：HSC可通过SDF-1/CXCR4轴促进肝癌细胞侵袭,其机制可能与诱导肝癌细胞上皮-间质转化有关。     

人骨髓基质干细胞克隆对脐血造血干细胞体外扩增作用的研究

目的：探讨人骨髓基质干细胞的克隆化培养及其对体外造血干细胞扩增的影响。方法：取正常肋骨分离骨髓，制备单个核细胞贴壁培养，约5d后取集落样生长的梭形细胞扩增培养，传代、将分选的脐血造血干／祖细胞接种到克隆培养的人骨髓基质干细胞及其他培养条件液上，比较不同培养条件及不同代次骨髓基质干细胞对造血干／祖细胞扩增能力及集落形成能力的影响。结果：人骨髓基质干细胞能扩增达20代以上，经流式细胞仪检测证实基质干细胞，单纯细胞因子组和细胞因子加基质干细胞组能有效扩增造血细胞，而后者有维持长期造血的作用。结论：该克隆培养方法能有效扩增骨髓基质干细胞，培养的细胞有体外支持长期造血的作用。     

活化的肝星状细胞对肝癌细胞增殖与侵袭的影响

目的 探讨活化的肝星状细胞（HSC）对肝癌细胞（CBRH7919）增殖与侵袭的影响及其可能机制.方法 采用Optiprep法分离HSC并进行鉴定、传代.建立肝星状细胞与肝癌细胞共培养体系.MTT法检测肝星状细胞对肝癌细胞增殖的影响.Transwell小室侵袭实验检测肝星状细胞对肝癌细胞侵袭能力的影响.Western blot法检测肝癌细胞基质金属蛋白酶-2（MMP-2）和核因子-κB（NF-κB）蛋白的表达.结果 成功分离、培养并鉴定为肝星状细胞.肝星状细胞能明显促进肝癌细胞增殖与侵袭（增殖：0.571 ±0.024 vs 0.803 ±0.048,1.271 ±0.044,1.973±0.036;侵袭：25.2±1.9 vs35.8±3.3,44.4±2.7,53.9±3.6）,差异有统计学意义（P＜0.05）.肝星状细胞明显提高肝癌细胞MMP-2（1.32±0.22 vs 2.46±0.39）和NF-κB（0.85 ±0.09 vs 1.44 ±0.21）的表达.结论 肝星状细胞能显著促进肝癌细胞的增殖和侵袭,可能与肝星状细胞促进肝癌细胞MMP-2及NF-κB表达增强有关.     

Effects of ribozyme targeting platelet-derived growth factor receptor β subunit gene on the proliferation and apoptosis of hepatic stellate cells in vitro

Background Activation and proliferation of hepatic stellate cells (HSC) is essentially involved in the development and progression of hepatic fibrosis. The most potent growth factor for HSC is platelet-derived growth factor receptor (PDGF) and PDGF receptor β subunit (PDGFR-β) is the predominant signal transduction pathyway of PDGF which is overexpressed in activated HSC. This study investigated the cleavage activity of hammerhead ribozyme targeting PDGFR-β mRNA in HSC and the effect on biological characteristics of HSC.Methods Expression vector of anti-PDGFR-β ribozyme was constructed and transfected into rat activated HSC with lipofectamin. The positive cell clones were gained by G418 selection. The expression of PDGFR-β, α-smooth muscle actin, and typeⅠand type Ⅲ collagen were detected by using Northern blot, Western blot and immunocytochemical staining, respectively. The cell proliferation was determined with MTT colorimetric assay. The cell apoptosis was analyzed by using flow cytometry, acridine orange fluorescence vital staining and transmission electron microscopy.Results The expression of PDGFR-β at mRNA and protein level was markedly reduced in ribozyme-transfected HSC by 49%-57% (P&lt;0.05-0.01). The proliferation and α-smooth muscle actin expression of ribozyme-transfected HSC were significantly decreased (P&lt;0.05-0.01), and the type Ⅰ and type Ⅲ collagen synthesis were also reduced (P&lt;0.01). In addition, the proliferative response of ribozyme-transfected HSC to PDGF BB was significantly inhibited. Otherwise, the apoptotic cells were significantly increased in ribozyme-transfected HSC (P&lt;0.01), and typical apoptotic cells could be found under transmission electron microscopy.Conclusions The anti-PDGFR-β ribozyme effectively cleaved the target RNA and significantly inhibited its expression, which blocked the signal transduction of PDGF at receptor level, inhibited HSC proliferation and collagen synthesis, and induced HSC apoptosis. These results suggest that inhibiting PDGFR-β expression of HSC may be a new target for the therapy of liver fibrogenesis, and ribozyme may be a useful tool for inhibiting PDGFR-β expression.