猪苓菌丝形成菌核栽培方法的研究

 目的 阐明在伴生菌的作用下,不同栽培方法对猪苓菌丝形成菌核的影响。方法 以树棒为载体,粗砂为基质,纯猪苓菌种、纯猪苓菌丝形成菌核伴生菌和蜜环菌为供试菌株,采用花盆栽培方法。结果 猪苓菌种和伴生菌间隔接种于树棒鱼鳞口和晚期接蜜环菌有利于猪苓菌核的形成和生长。结论 伴生菌是猪苓菌丝形成菌核的关键生物因子;蜜环菌是猪苓菌核继续生长发育的主要营养来源。     

猪苓与蜜环菌化学成分研究的相关分析进展

共生的猪苓Polyporus umbellatus与蜜环菌Armillaria mellea均为药食兼用真菌,具有降血糖、调节免疫、抑制肿瘤等多种生物活性。猪苓菌核经菌丝体发育而来,其生长过程与共生蜜环菌有关;受其侵染,猪苓菌丝体可形成菌核。该文通过分析猪苓菌丝体、菌核和蜜环菌的化学成分,发现三者均含有甾体和含氮杂环等化合物,且猪苓菌核与蜜环菌中还含有三萜类次生代谢产物。猪苓菌核及其菌丝体的甾体种类存在显著差异,但部分成分存在一定的相关性。此外,猪苓菌核还特有长链脂肪酸、酰胺和苯酚等多种化合物,推测这些可能是因蜜环菌入侵而形成的多种次生代谢产物;而蜜环菌自身主要产生倍半萜、二萜等物质。猪苓与蜜环菌的化合物含量、种类与其共生繁殖密切相关,目前尚需对二者的共生机制进行深入研究,为提高二者产量及质量提供科学依据。     

高卢蜜环菌PCR-RFLP快速鉴别方法研究

蜜环菌是名贵中药天麻、猪苓栽培过程中必备的共生菌,蜜环菌的菌索侵入天麻块茎或猪苓菌核后被后者消化利用,成为它们重要的营养源。不同性质的蜜环菌影响天麻、猪苓的生长。作者收集了13个地区的市售蜜环菌,经过IGS鉴定均为高卢蜜环菌。在基因水平和代谢水平上筛选出了蔗糖含量具有显著差异的2种高卢蜜环菌,命名为A型和B型,并建立了简单、准确的高卢蜜环菌DNA分子标记鉴定方法。通过比较高卢蜜环菌A型和B型蔗糖酶基因序列差异,根据差异片段设计聚合酶链反应-限制性内切酶酶切长度多态(PCR-RFLP)鉴别方法,即引物ZTM.F/ZTM.R可扩增高卢蜜环菌A型和B型,产生约304 bp长度条带,限制性内切酶EcoR V可以识别高卢蜜环菌A型和B型的差异序列,仅高卢蜜环菌B型可以被酶切形成2个片段,从而特异性鉴别高卢蜜环菌为B型。该实验建立的PCR-RFLP可以作为高卢蜜环菌A型和B型的DNA鉴别方法。在天麻和猪苓的栽培过程中,可根据品种、生长阶段、生态环境等不同需要,选择合适的菌株,因地制宜提升它们的产量和品质。     

药用真菌猪苓菌核无机磷酸盐转运蛋白基因的分子克隆与特性分析

目的克隆猪苓Polyporus umbellatus菌核无机磷酸盐转运蛋白基因并进行生物信息学和表达模式分析。方法采用RT-PCR技术从猪苓菌核中克隆得到1个无机磷酸盐转运蛋白(inorganic phosphate transporter)基因,利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域、信号肽和跨膜结构等分子特性;采用Clustal W2以及MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;实时荧光定量PCR分析基因表达模式。结果猪苓无机磷酸盐转运蛋白基因命名为Pu Pi T(NCBI登录号:KU179154)。该基因开放读码框全长为1 590 bp,编码530个氨基酸。Pu Pi T蛋白相对分子质量为57 552,等电点6.82。氨基酸序列分析表明,Pu Pi T蛋白具有12个跨膜区。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示Pu Pi T与Moniliophthora rorer亲缘关系最近,与Moniliophthora roreri、双色蜡蘑Laccaria bicolor、Heterobasidion irregulare有较高的同源性,荧光定量PCR结果表明,Pu Pi T在与蜜环菌共生的猪苓菌核及未与蜜环菌共生的菌核中都有表达,其中共生部分的表达量显著上调,约是未共生部位的12倍,说明其参与猪苓与蜜环菌共生过程。结论 Pu Pi T基因克隆和分子特征为进一步研究揭示其在猪苓菌核磷元素转运及与蜜环菌共生过程中的调控作用奠定基础。     

猪苓营养源的初步研究

目的:进一步验证猪苓生长与蜜环菌之间的关系。方法:以不同的培养基配比,不同的菌种配比,测定猪苓菌丝和猪苓菌核生长速度,筛选最佳的营养源及进一步验证猪苓生长与蜜环菌的关系。结果:猪苓菌丝的生长,无需蜜环菌提供营养,棉籽壳是较好的营养源,可以代替栎木屑;以棉籽壳90%、麦麸5%、玉米粉3%、大豆粉2%为培养基,猪苓菌丝生长良好;只接猪苓菌种,没有蜜环菌,15℃培养,猪苓菌核160 d直径可达74 mm。结论:蜜环菌在猪苓生长中不起积极作用,反而与猪苓争夺基质中的营养,蜜环菌原种接种量越大,效果越差。     

与蜜环菌共生过程中猪苓菌核不同部位糖类成分的含量研究

目的 通过猪苓菌核与蜜环菌共生过程中不同部位糖类成分的含量测定，明确蜜环菌对猪苓菌化学成分的影响，为进一步阐明二者的相互作用关系和指导猪苓菌核的合理采收提供科学依据。方法 采用高效液相分析法（HPLC）。结果 蜜环菌侵染的猪苓菌核部位和4年生菌核糖类成分含量高于其它部分。结论 蜜环菌的侵染不但促进了猪苓菌核的繁殖和生长，而且对猪苓菌核糖类成分含量的提高也有显著作用。     

猪苓与蜜环菌营养关系的初步探讨

目的 :深入探讨猪苓与蜜环菌的关系。方法 :以蜜环菌侵染的猪苓菌核、未被蜜环菌侵染的猪苓菌核以及蜜环菌索为材料。采用硅胶G薄层层析和薄层扫描法。激发波长为 365nm ,发射波长为 550nm。结果 :蜜环菌侵染猪苓菌核后形成的隔离腔环带、腔内菌丝以及纯蜜环菌索具有相同的荧光斑点。且对第 5个荧光斑点分别进行薄层扫描 ,腔内菌丝该成分相对含量为38.19% ,腔上环带菌丝为 33.62 % ,而纯猪苓菌丝为 6.99%。结论 :说明蜜环菌的代谢产物通过隔离腔供猪苓菌生长发育需要。     

水仙内生真菌的分离鉴定及聚类分析

目的 分离纯化水仙根茎中的内生真菌,并进行菌群组成及其多样性分析。方法 采用表面消毒、划线法从水仙鳞茎和根中分离内生真菌,基于形态学特征和核糖体转录间隔区（ITS-rDNA）序列分析,对分离株进行分类鉴定;以内生真菌的多样性指数（H）和均匀度指数（E）为指标,分析水仙内生真菌的菌群组成及其多样性。结果 共分离到18株内生真菌,其中16株来自根部,2株来自鳞茎,分别占总分离菌株的88.89%和11.11%。PCR扩增其中14株真菌ITS-rDNA,得到大小约500 bp片段,用BLAST软件对其测序结果进行相似性比对,发现4株为青霉属Penicillium,相似性95%～99%;3株为曲霉属Aspergillus,相似性99%～100%;3株为喙枝孢属Rhinocladiella,相似性为99%;其他4株分别为木霉属Trichoderma、链格孢属Alternaria、赤霉属Gibberella和镰孢霉属Fusarium,相似性都为99%。青霉菌为水仙内生真菌优势菌属。通过构建系统发育树发现这14株内生菌明显分为2大类群,Shannon多样性指数为1.778,均匀度为0.913 7。结论 水仙内生真菌菌群组成具有一定程度的多样性和差异性。     

伴生菌对猪苓几种酶活性的影响

目的 :研究猪苓Grifolaumbellata在与伴生菌Companionfungus共培养过程中 ,伴生菌对猪苓几种酶的活性影响。方法 :测定与伴生菌共培养过程中猪苓菌丝几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶及胞外多酚氧化酶的活性。结果 :伴生菌能诱导猪苓几丁质酶及 β-1,3-葡聚糖酶活性的提高 ;蛋白酶活性没有明显变化 ;液体培养时 ,在培养的后期猪苓与伴生菌共培养的发酵液中两种胞外多酚酶活性均居于猪苓与伴生菌单独培养的酶活性之间。结论 :伴生菌与猪苓的营养互补可能为猪苓提供一些菌核形成的相关物质 ,从而有利于猪苓形成菌核。     

蜜环菌的化学成分研究

对蜜环菌Armillaria mellea发酵培养物的化学成分进行研究。采用硅胶、Sephadex LH-20柱色谱等方法进行分离纯化,根据波谱数据及与对照品对照鉴定化合物结构。从蜜环菌发酵培养物中分离鉴定了10个化合物,分别为2-羟基-4-甲氧基-6-甲基苯甲酸(1),苔藓酸(2),蜜环菌戊素(3),麦角甾醇(4),染料木素(5),大豆素(6),胡萝卜苷(7),染料木苷(8),尿嘧啶(9)和甘露醇(10)。化合物 1~10 均为首次从蜜环菌发酵培养物中分离得到,其中,化合物 1~4,6,10 在蜜环菌菌丝体或菌索中已有报道。通过二维核磁波谱确证,首次报道化合物3以DMSO为溶剂的氢、碳谱数据,是对该类成分波谱数据的补充。     

猪苓药材质量影响因素及质量评价的研究进展

通过对近年来相关文献进行整理,介绍了目前对猪苓化学成分的相关研究,包括对猪苓多糖、甾体类成分及其他成分的研究,系统地介绍了影响猪苓药材质量的有关因素,如品种、产地、栽培、采收与加工,同时比较、分析了评价猪苓质量的提取、鉴别和含量测定方法等.作为一种常用中药材,猪苓药材的质量影响着其在临床使用的疗效,通过对质量影响因素以及质量评价方法的整理,为保证猪苓药材质量提供合理的依据.     

伴生菌对猪苓菌丝生长及多糖含量的影响

目的：研究伴生菌对猪苓菌丝的生物量及多糖含量的影响。方法：将伴生菌的胞内及胞外成分添加到猪苓的液体发酵体系中，发酵培养结束后测定猪苓菌丝的生物量及多糖含量。结果：添加伴生菌菌丝体及适量的未经灭菌的伴生菌发酵液可显著提高猪苓菌丝的生物量，而添加经灭菌的伴生菌发酵液可显著降低猪苓菌丝的生物量；添加伴生菌菌丝体及发酵液均可显著提高猪苓菌丝多糖含量，而显著降低猪苓胞外多糖含量。结论：伴生菌的胞内及胞外成分可在今后猪苓发酵生产时有选择地利用。     

假单胞杆菌、灵芝等几种菌的发酵液对猪苓菌生长的影响

 目的：证明在猪苓菌发酵过程中加入假单胞杆菌、灵芝、金针菇等几种菌的发酵液对猪苓多糖产生是否具有促进作用。方法：采用平板培养法、发酵培养法。平板培养法直接测定生长量；发酵培养所得的发酵液采用3，5-二硝基水杨酸法测定多糖含量。结果：在猪苓菌发酵培养过程中加入假单胞杆菌、灵芝、金针菇等几种菌的发酵液可使猪苓菌球数量增多、重量大、多糖含量高。以假单胞杆菌发酵液的处理效果最佳；在平板培养时，培养25d菌落直径达72．25mm，在发酵培养过程中，在最佳产糖期发酵液中粗多糖含量达7．800mg·ml^－1，而对照分别为48．63mm和5．200mg·ml^－1。结论：在猪苓菌丝体培养过程中加入假单胞杆菌、灵芝、金针菇等几种菌的发酵液均对其菌丝的生长及发酵过程中多糖的产生具有促进作用。     

液体深层培养猪苓多糖脱色技术的研究

 目的研究液体深层培养猪苓菌丝体水提部位粗多糖脱色的最佳工艺条件。方法采用单因素试验和正交试验分别考察双氧水、活性炭、DEAE纤维素等3种脱色剂对菌丝体粗多糖的脱色效果,用光谱扫描法检测光吸收强度的变化。结果活性炭作为脱色剂,效果优于其他2种,脱色最佳工艺条件为:温度60℃,时间40min,活性炭添加量3g·100mL^-1。结论实验中优化后的脱色方法简便、易行,也为猪苓菌丝体多糖的工业化提取中脱色工序的操作提供理论依据。     

猪苓多糖硫酸酯的制备及活性测定

目的:制备猪苓多糖硫酸酯,同时测定其活性.方法:采用醇沉分级、大孔吸附树脂、聚酰胺树脂和脱蛋白法从中药猪苓中提取分离得到猪苓多糖,硫磺酸-吡啶法进行硫酸酯化,经Sephadex G-75、透析得到硫酸化猪苓多糖,并体外观察硫酸酯化多糖对羟基自由基清除作用.结果:猪苓多糖硫酸酯化前后均有清除Fenton反应由Fe2+-H2O2体系产生的羟自由基,硫酸酯化猪苓多糖对羟自由基的清除能力增强,并呈明显量效关系.结论:制备猪苓多糖硫酸酯的方法准确可靠,为猪苓多糖的进一步开发利用提供实验依据.     

Bioactivity-directed isolation, identification of diuretic compounds from Polyporus umbellatus

Aim of the study

Polyporus umbellatus is a fungus used as a diuretic medicine. The objective of this study was to isolate and elucidate the diuretic constituents of n-hexane, ethyl acetate, n-butanol and water extracts of Polyporus umbellatus and to evaluate their diuretic activity.

Materials and methods

The n-hexane, ethyl acetate, n-butanol and water extracts of Polyporus umbellatus were tested by diuretic experiment of normal rats in metabolic cage. The n-hexane extract and n-butanol extract were prepared separately by the bioassay-guided approach. Three isolated compounds doses (5, 10 and 20 mg/kg BW) were orally administered to normal rats. Water excretion rate, pH and content of Na⁺, K⁺ and Cl⁻ were measured in the urine of saline-loaded rats.

Results

n-Hexane extract (P < 0.05), n-butanol extract (P < 0.05) and three isolated compounds (ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one, ergosterol and d-mannitol) displayed diuretic activity.

Conclusions

The ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one was the strongest diuretic constituent in the three compounds. Ergosterol and d-mannitol were found to be also responsible for duiretic effects in Polyporus umbellatus for the first time. Data show that 20 mg/kg dose of the ergosterol for urine out put became significantly higher than in the control rats, but the ratio of Na⁺/K⁺ almost unaltered in the three doses. The highest dose of the d-mannitol was significant and increased the cumulative urine output. Regarding the electrolyte excretion, data show that the doses 10 and 20 mg/kg produce significant increase for excretion of Na⁺ and Cl⁻. The present results provide a quantitative basis explaining application of Polyporus umbellatus as a diuretic medicine. The result proved that its diuretic effects were also due to the contribution of multi-components in clinical application.     

猪苓菌核2种热激蛋白基因的克隆及其表达分析

该研究采用RT-PCR技术从中国野生猪苓菌核Polyporus umbellatus中克隆得到2种热激蛋白基因,其中Pu Hsp90基因的开放阅读框2 091 bp,编码696个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量约78.9 k Da;Pu Hsp70基因的开放阅读框1 944 bp,编码647个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量约70.5 k Da;蛋白质结构预测及同源比对分析表明,这2个基因编码的核苷酸序分别具有Hsp90,Hsp70蛋白的保守结构域。进化树分析表明,Pu Hsp90与变色栓菌Hsp90聚为一类,Pu Hsp70与肝色牛排菌Hsp70聚为一类。qRT-PCR分析表明,蜜环菌侵染的情况下,这2个基因在猪苓菌核中均上调表达。这2个基因在蜜环菌侵染猪苓菌核的状态下有相同的表达模式,预示这2个基因其可能在抗生物胁迫中起重要作用。     

紫花前胡分类位置修订的分子基础研究

目的:从核DNA ITS序列角度阐明紫花前胡分类位置修订的分子基础。方法:PCR扩增、DNA序列测定、分支分析法进行研究。结果:得到紫花前胡、白花前胡、白芷、泰山前胡、骨缘当归的ITS序列和系统发育树,其中紫花前胡和白芷、骨缘当归聚为一组,泰山前胡和白花前胡聚为另一组。结论:紫花前胡应为当归属植物,紫花前胡和白花前胡应分别入药。