猪苓菌丝形成菌核栽培方法的研究

 目的 阐明在伴生菌的作用下,不同栽培方法对猪苓菌丝形成菌核的影响。方法 以树棒为载体,粗砂为基质,纯猪苓菌种、纯猪苓菌丝形成菌核伴生菌和蜜环菌为供试菌株,采用花盆栽培方法。结果 猪苓菌种和伴生菌间隔接种于树棒鱼鳞口和晚期接蜜环菌有利于猪苓菌核的形成和生长。结论 伴生菌是猪苓菌丝形成菌核的关键生物因子;蜜环菌是猪苓菌核继续生长发育的主要营养来源。     

猪苓培养条件的确立及其与蜜环菌共同培养的研究

目的确立猪苓母种和原种的培养条件,揭示猪苓菌丝和蜜环菌菌索共同培养条件下的生长特性。方法采用培养皿固体培养法,定期测定分析猪苓菌丝和蜜环菌菌索的形态特征及生长指标。结果黄豆饼粉培养基以麸皮做碳源较好,C∶N以4∶1为佳。在母种培养基上,猪苓菌丝的长速显著高于蜜环菌菌索,蜜环菌菌索可穿透猪苓菌丝而继续生长。在原种培养基上猪苓菌丝可正常生长,蜜环菌菌索生长受抑制。结论明确了猪苓母种和原种的最佳培养条件及其与蜜环菌共培养的生长特性。     

猪苓营养源的初步研究

目的:进一步验证猪苓生长与蜜环菌之间的关系。方法:以不同的培养基配比,不同的菌种配比,测定猪苓菌丝和猪苓菌核生长速度,筛选最佳的营养源及进一步验证猪苓生长与蜜环菌的关系。结果:猪苓菌丝的生长,无需蜜环菌提供营养,棉籽壳是较好的营养源,可以代替栎木屑;以棉籽壳90%、麦麸5%、玉米粉3%、大豆粉2%为培养基,猪苓菌丝生长良好;只接猪苓菌种,没有蜜环菌,15℃培养,猪苓菌核160 d直径可达74 mm。结论:蜜环菌在猪苓生长中不起积极作用,反而与猪苓争夺基质中的营养,蜜环菌原种接种量越大,效果越差。     

与蜜环菌共生过程中猪苓菌核不同部位糖类成分的含量研究

目的 通过猪苓菌核与蜜环菌共生过程中不同部位糖类成分的含量测定，明确蜜环菌对猪苓菌化学成分的影响，为进一步阐明二者的相互作用关系和指导猪苓菌核的合理采收提供科学依据。方法 采用高效液相分析法（HPLC）。结果 蜜环菌侵染的猪苓菌核部位和4年生菌核糖类成分含量高于其它部分。结论 蜜环菌的侵染不但促进了猪苓菌核的繁殖和生长，而且对猪苓菌核糖类成分含量的提高也有显著作用。     

药用真菌猪苓共生的蜜环菌种类研究

 目的 对国内猪苓产区与猪苓共生的蜜环菌种类进行探究。方法 经PDA平板培养后长出健壮的蜜环菌根状菌索。运用IGS测序技术对分离的22株蜜环菌菌株的纯培养菌种进行分子鉴定,并基于蜜环菌的IGS序列进行核酸序列数据库GenBank同源序列比对、构建系统发育树。结果 本实验获得的猪苓菌核组织分离的22株蜜环菌菌株为其纯培养菌种。基于IGS的系统发育分析表明,与猪苓菌核共生的蜜环菌分别属于Armillaria cepistipes, A.gallica, A. ostoyae以及A. mellea 4个种,其中A.cepistipes, A. gallica分别分离得到10株,为优势种。结论 猪苓共生对蜜环菌物种专一性较低,与相关书籍及文献报道的与猪苓共生蜜环菌为单一A. mellea种的结论不符。与猪苓共生的蜜环菌多样性及不同种类蜜环菌对猪苓菌核生长发育的影响需进一步研究。     

猪苓与蜜环菌化学成分研究的相关分析进展

共生的猪苓Polyporus umbellatus与蜜环菌Armillaria mellea均为药食兼用真菌,具有降血糖、调节免疫、抑制肿瘤等多种生物活性。猪苓菌核经菌丝体发育而来,其生长过程与共生蜜环菌有关;受其侵染,猪苓菌丝体可形成菌核。该文通过分析猪苓菌丝体、菌核和蜜环菌的化学成分,发现三者均含有甾体和含氮杂环等化合物,且猪苓菌核与蜜环菌中还含有三萜类次生代谢产物。猪苓菌核及其菌丝体的甾体种类存在显著差异,但部分成分存在一定的相关性。此外,猪苓菌核还特有长链脂肪酸、酰胺和苯酚等多种化合物,推测这些可能是因蜜环菌入侵而形成的多种次生代谢产物;而蜜环菌自身主要产生倍半萜、二萜等物质。猪苓与蜜环菌的化合物含量、种类与其共生繁殖密切相关,目前尚需对二者的共生机制进行深入研究,为提高二者产量及质量提供科学依据。     

不同年龄的野生与家种猪苓菌核氨基酸及微量元素分析

<正> 猪苓属多孔菌科真菌,其菌核供药用,具有利水渗湿等功能。自1978年山西古县猪苓场报道人工培植猪苓菌核以来,猪苓菌核依靠蜜环菌侵染提供营养已被各地的人工栽培进一步证实。作者曾对猪苓菌核的结构性质、不同     

高卢蜜环菌PCR-RFLP快速鉴别方法研究

蜜环菌是名贵中药天麻、猪苓栽培过程中必备的共生菌,蜜环菌的菌索侵入天麻块茎或猪苓菌核后被后者消化利用,成为它们重要的营养源。不同性质的蜜环菌影响天麻、猪苓的生长。作者收集了13个地区的市售蜜环菌,经过IGS鉴定均为高卢蜜环菌。在基因水平和代谢水平上筛选出了蔗糖含量具有显著差异的2种高卢蜜环菌,命名为A型和B型,并建立了简单、准确的高卢蜜环菌DNA分子标记鉴定方法。通过比较高卢蜜环菌A型和B型蔗糖酶基因序列差异,根据差异片段设计聚合酶链反应-限制性内切酶酶切长度多态(PCR-RFLP)鉴别方法,即引物ZTM.F/ZTM.R可扩增高卢蜜环菌A型和B型,产生约304 bp长度条带,限制性内切酶EcoR V可以识别高卢蜜环菌A型和B型的差异序列,仅高卢蜜环菌B型可以被酶切形成2个片段,从而特异性鉴别高卢蜜环菌为B型。该实验建立的PCR-RFLP可以作为高卢蜜环菌A型和B型的DNA鉴别方法。在天麻和猪苓的栽培过程中,可根据品种、生长阶段、生态环境等不同需要,选择合适的菌株,因地制宜提升它们的产量和品质。     

蜜环菌菌材高效培养体系的建立

目的:建立蜜环菌菌材的高效培养体系。方法:在不同母种培养基、pH、温度、原种培养料、菌材培养料、坡向等条件下对蜜环菌进行培养,测定蜜环菌菌索的长度、干重及桦木段和猪苓苓种接菌率。结果:松针培养基中蜜环菌菌索长度比玉米浆培养基、牛肉膏培养基、松香培养基分别高出45.2%、8.0%、43.2%,干重分别高出121.5%、33.7%、211.2%;pH5、pH6和pH7条件下蜜环菌菌索长度和干重差异不显著,但显著高于pH4;20℃和25℃条件下蜜环菌菌索长度和干重显著高于15℃和30℃;桦木屑培养料中蜜环菌菌索生长最快,菌索干重最大;0.25%NH_4NO_3溶液浸泡桦木段和湿树叶伴栽可显著提高桦木段和苓种接菌率;桦木段和苓种在半阴半阳坡的接菌率显著高于阳坡和阴坡。结论:蜜环菌菌材高效培养体系:以松针培养基做为母种培养基,pH为5~7;以桦木屑培养料做为原种培养料;以"桦木段(0.25%NH_4NO_3溶液浸泡)+湿树叶+腐殖土"做为菌材培养料;室内培养温度为20~25℃,室外培养宜在半阴半阳坡选址。     

药用真菌猪苓菌核无机磷酸盐转运蛋白基因的分子克隆与特性分析

目的克隆猪苓Polyporus umbellatus菌核无机磷酸盐转运蛋白基因并进行生物信息学和表达模式分析。方法采用RT-PCR技术从猪苓菌核中克隆得到1个无机磷酸盐转运蛋白(inorganic phosphate transporter)基因,利用生物信息学软件预测蛋白的理化性质、结构域、信号肽和跨膜结构等分子特性;采用Clustal W2以及MEGA 6.0分别进行氨基酸多序列比对和进化关系分析;实时荧光定量PCR分析基因表达模式。结果猪苓无机磷酸盐转运蛋白基因命名为Pu Pi T(NCBI登录号:KU179154)。该基因开放读码框全长为1 590 bp,编码530个氨基酸。Pu Pi T蛋白相对分子质量为57 552,等电点6.82。氨基酸序列分析表明,Pu Pi T蛋白具有12个跨膜区。氨基酸序列多重比对及系统发育树结果显示Pu Pi T与Moniliophthora rorer亲缘关系最近,与Moniliophthora roreri、双色蜡蘑Laccaria bicolor、Heterobasidion irregulare有较高的同源性,荧光定量PCR结果表明,Pu Pi T在与蜜环菌共生的猪苓菌核及未与蜜环菌共生的菌核中都有表达,其中共生部分的表达量显著上调,约是未共生部位的12倍,说明其参与猪苓与蜜环菌共生过程。结论 Pu Pi T基因克隆和分子特征为进一步研究揭示其在猪苓菌核磷元素转运及与蜜环菌共生过程中的调控作用奠定基础。     

猪苓菌丝固体培养特性研究

利用固体琼脂培养基对猪苓暗培养,观测不同培养基、不同碳源、不同氮源、不同温度对猪苓生长和菌丝形态的影响,并测定猪苓在两种不同培养基上菌丝产生猪苓酮类成分的差异.结果表明: 1. 猪苓菌的营养需求比较简单,在只有碳源和氮源的简单培养基上均能生长; 2. 麦芽汁培养基、GPY培养基和GPC培养基比较适合于猪苓菌固体培养; 3. 玉米浆、酵母膏、奶粉、硫胺素、伴生菌提取物、蜜环菌提取物、活性白土、硅藻土、高岭土等对猪苓生长都显示出促进作用; 4. 固体培养猪苓菌丝能分泌黑色素; 5. 麦芽汁培养以及以甘油、甘露醇为碳源的培养基,都可以诱导猪苓菌丝形成菌核; 6. 麦芽汁培养基和甘油培养基上培养获得的菌丝体中含有猪苓酮类成分.     

猪苓菌核2种热激蛋白基因的克隆及其表达分析

该研究采用RT-PCR技术从中国野生猪苓菌核Polyporus umbellatus中克隆得到2种热激蛋白基因,其中Pu Hsp90基因的开放阅读框2 091 bp,编码696个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量约78.9 k Da;Pu Hsp70基因的开放阅读框1 944 bp,编码647个氨基酸,推导的蛋白质相对分子质量约70.5 k Da;蛋白质结构预测及同源比对分析表明,这2个基因编码的核苷酸序分别具有Hsp90,Hsp70蛋白的保守结构域。进化树分析表明,Pu Hsp90与变色栓菌Hsp90聚为一类,Pu Hsp70与肝色牛排菌Hsp70聚为一类。qRT-PCR分析表明,蜜环菌侵染的情况下,这2个基因在猪苓菌核中均上调表达。这2个基因在蜜环菌侵染猪苓菌核的状态下有相同的表达模式,预示这2个基因其可能在抗生物胁迫中起重要作用。     

蜜环菌不同发育阶段多糖成分的研究

目的 :对蜜环菌不同发育阶段体内多糖的性质和含量进行研究。方法 :提取、分离、纯化蜜环菌菌丝体、发酵液、菌索和子实体多糖 ,应用红外光谱分析法、高效液相色谱法、凝胶渗透色谱法和凝胶色谱法等方法测定蜜环菌 4种多糖的性质、多糖组成、多糖含量和多糖分子量。结果 :蜜环菌菌丝体和发酵液多糖为单一葡萄糖组成的葡聚糖 ;菌索和子实体多糖由葡萄糖、木糖组成 ,这两种单糖在菌索多糖中的摩尔比为 1∶14,在子实体多糖中的摩尔比为 1∶10。蜜环菌多糖的分子量为 1万～7万。蜜环菌不同发育阶段多糖含量分别为菌丝体含 9.00% ;发酵液含 0.87g·(100ml)^-1;菌索含 1.12% ;子实体含 2.27%。结论 :蜜环菌不同发育阶段多糖成分的研究 ,为综合开发利用蜜环菌提供了科学依据。     

SmartRoot在蜜环菌菌索表型谱分析中的应用

目的:建立获取精确的表型谱数据研究平台,是目前中药资源研究亟待解决的技术难点。如传统的蜜环菌菌索表型表征方式多为描述性文字,存在较大的主观性和经验性,亟需一种客观并准确的方法进行蜜环菌菌索表型的表征。方法:基于图像处理软件Image J和根系识别插件SmartRoot与Synbiosis ProtoCol 3影像分析仪相结合,对蜜环菌平板生长图片进行分析,测定蜜环菌菌索长度、生长速度、分枝情况、新生菌索夹角等,建立蜜环菌菌索表型谱分析测量体系。结果:基于该文开发的方法,可以在不影响蜜环菌生长情况下,实时分析蜜环菌菌索的生长长度、生长速度、分枝数、新生菌索夹角等表型谱变化,继代后9～12 d的蜜环菌生长最为迅速,新生菌索与母体菌索之间夹角接近垂直。该方法与传统的蜜环菌生物量表型参数干重呈现一定的相关性,具有较好的实际应用价值。结论:该研究建立了一套客观、准确、快捷和实时的蜜环菌菌索表型谱分析测量体系,拓展了SmartRoot的应用范围,可用于受控实验条件下中药资源的表型谱分析。     

蜜环菌菌种的复壮研究

目的:研究蜜环菌菌种的复壮问题。方法:应用摇瓶扩繁无性后代的方法,观察几种培养基和不同培养方法对蜜环菌菌索形成的影响,并挑取新鲜粗壮菌索的先端部分进行斜面培养。结果:在富含有机氮的半固体培养基上蜜环菌最易形成粗壮的菌索。结论:选择适当的培养基及培养方法摇瓶扩繁蜜环菌后代,再进行选择培养是复壮蜜环菌菌种最简易的方法。     

滇西南地区不同道地树种对蜜环菌生长的影响

目的:筛选滇西南地区最适合天麻蜜环菌生长的道地树种。方法:选用滇西南地区32种常见阔叶树种,制作蜜环菌三级种培养基培养蜜环菌,比较蜜环菌在不同树种中的生长速度及菌索生长状况。结果:白檀培养基中,蜜环菌的生长速度快,菌索发生变异,呈扇形,生长状况良好;蜜环菌在欧洲山毛榉等20种树种配制的培养基中,菌索的生长速度和菌索外部形态特征都正常;紫丁香、木通、木莲、厚皮香、金叶子、辣木树、化香树、团香果、白杜鹃和多花含笑,这11种树种的蜜环菌生长速度和生长状况不理想。结论:白檀是培养蜜环菌三级种的优良树种;欧洲山毛榉等20种树种也可做为蜜环菌三级种培养的培养基成分;紫丁香等11种树不适合蜜环菌的生长,不能作为蜜环菌培养的培养基成分。     

蜜环菌遗传转化体系的建立

目的:利用农杆菌介导法,建立蜜环菌的遗传转化体系,为分子学研究奠定基础。方法:将含有EGFP的表达载体转入农杆菌EHA105中,构建农杆菌工程菌。把成熟的蜜环菌菌索剪断并浸泡在农杆菌中,在乙酰丁香酮的作用下,农杆菌工程菌将EGFP基因整合到蜜环菌基因组中。利用PCR法和荧光观察法筛选并检测蜜环菌菌株的转化情况。结果:转化成功的蜜环菌其基因组中含有EGFP基因,并且其后代遗传稳定,通过荧光显微镜能够检测到绿色的荧光点。结论:农杆菌介导的蜜环菌遗传转化体系是一种效率较高,简便快速的转化方法,能够将目的基因转入到蜜环菌中并成功表达。     

"猪苓"有望不"紧缺"

中国医科院药用植物研究所研究员、博士生导师郭顺星在前人工作的基础上,经过多年努力,在猪苓菌丝、猪苓菌核及其繁育技术研究等方面取得新的突破。 猪苓为多孔菌科药用真菌猪苓的菌核,具有良好的利水渗湿作用,还可抗肿瘤。由于过度采挖,目前我国野生猪苓资源已处于濒危状态。虽然通过猪苓菌核自身繁殖及猪苓的半野生栽培有望使目前的药源紧缺状况得到缓解,但是猪苓菌核数量有限,制约了猪苓半野生栽培技术的普及与推广。加之猪苓菌核生长速度缓慢,一般需要3～5年才能长成,而由猪苓菌丝繁殖菌核则是解决上述矛盾的有效途径之一。 郭…     

猪苓菌核不同发育时期转录组学差异表达研究

药用真菌猪苓菌核的发育代谢过程一直备受关注。为了解猪苓菌核的发育历程,该研究对3个不同时期的猪苓菌核进行了转录组学分析,共得到88. 12 Gb测序数据,包含85 235条unigene。对差异基因进行深度挖掘,筛选了有关跨膜运输、防御、极性生长、形态发育、黑色素合成、细胞壁合成、药效成分麦角甾醇和猪苓多糖合成功能的DEGs,从而推测了菌核发育的分子机制。根据DEGs的通路富集注释结果和相关报道,进一步推测猪苓菌核的发育是由于非生物胁迫(温差和缺氧)和生物胁迫(共生菌蜜环菌和伴生菌的入侵)诱导所致,造成菌核的氧化应激状态,加速合成膜转运蛋白和麦角甾醇从而实现物质的跨膜运输和转换,并通过WD40蛋白实现自身的防御机制。小GTPase和细胞色素P450响应环境信号,进而调控细胞的极性生长和形态发生,期间表皮黑色素沉积,细胞壁加厚,猪苓多糖合成,最终使得猪苓菌核的发育成熟。猪苓菌核不同时期转录组的研究为今后解析其发育历程和相关代谢过程的分子机制奠定了坚实的基础。     

高温胁迫对蜜环菌生长特性的影响

目的:探究高温胁迫对不同蜜环菌生长特性的影响,为筛选耐高温的优良蜜环菌菌株提供指导。方法:以14株不同天麻产区的蜜环菌为实验材料,观察各蜜环菌菌株的生长特性并进行表型分类;采用rDNA-IGS序列分析进行分子鉴定,进一步确定供试菌株的亲缘关系;以23℃条件为对照(CK),30℃为高温胁迫,记录各菌株生长速度,生物量,菌索长度等指标。结果:14株蜜环菌均与高卢蜜环菌Armillaria gallica相似性最高,亲缘关系最相近;但不同天麻产区的蜜环菌菌株生长特性存在明显差异,将14株蜜环菌分为Ⅳ个类群,其中生长状态:第Ⅰ类群第Ⅱ类群第Ⅲ类群第Ⅳ类群;高温胁迫后,各菌株对高温的耐受性也存在明显差异,表现在菌索平均生长速度GZ16SX1GZ1;相对菌索长度GZ16SX1GZ3;相对生物量GZ16SX4GZ1HB1AH2;生长状态GZ16SX1GZ1。结论:高温胁迫下,GZ16在生长速度,相对菌索长度,相对生物量及生长状态等均最优,SX1,GZ1菌株次之。表明菌株GZ16,SX1,GZ1耐高温能力较强,且这3个菌株在正常温度下生长特性也优良,适宜全国主要天麻产区生产。