药用植物三尖杉内生真菌的分离鉴定及抗菌活性

目的：研究药用植物三尖杉Cephalotaxus fortunei内生真菌的分离鉴定及抗菌活性。方法：用组织培养方法从野生三尖杉的根、茎、叶中分离内生真菌,采用滤纸片扩散法对分离得到的内生真菌的代谢产物做抑菌活性研究。结果：分别从三尖杉根、茎、叶中共分离得到30株内生真菌;抑菌活性研究显示,有20株内生真菌的代谢产物至少对1种靶标菌有抑制活性,占总分离菌株的66.7%,其中菌株CFEF013对所有靶标菌均有抑制作用;经形态学和分子生物学鉴定,对7株具有较强抑菌活性的菌株分属镰孢菌属Fusarium 4株,壳囊孢属Cytospora 1株,拟盘多毛孢属Pestalotiopsis 1株,毛霉菌属Mucor 1株。结论：药用植物三尖杉内生真菌种类具有一定的多样性,内生真菌代谢产物抑菌活性良好。     

川楝内生真菌的遗传及PKS、NRPS基因的多样性

目的 探明川楝Melia toosendan内生真菌遗传、聚酮合成酶基因（PKS）、非核糖体多肽合成酶基因（NRPS）多样性,为寻找合成生物活性物质的潜在菌株奠定基础。方法 对分离自药用植物川楝的39株内生真菌进行形态学鉴定,并通过PCR技术扩增其ITS序列、PKS基因和NRPS基因,测序后进行BLAST比较和系统发育分析。结果 39株菌株的表型鉴定和系统发育显示,川楝内生真菌分属于青霉属、曲霉属、木霉属等25个属,其中曲霉属（17.9%）、青霉属（15.4%）为川楝内生真菌的优势真菌类群;共得到12个PKS基因和6个NRPS基因,其中NRPS基因都为青霉属。结论 川楝内生真菌具有非常丰富的遗传多样性和较强合成生物活性物质的潜在能力,对青霉属和曲霉属内生真菌可以进行深入研究。     

水仙内生真菌的分离及抑菌和抗肿瘤活性研究

目的 分离纯化水仙根茎中的内生真菌,并对分离得到的真菌进行抑菌和抗肿瘤活性筛选。方法 用组织分离法分离纯化水仙内生真菌后,以金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、大肠杆菌Escherichia coli、绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa、肺炎克雷伯菌Klebsiella pneumoniae和人肝癌细胞HepG2作为受试对象,采用滤纸片法和MTT法对内生真菌菌株发酵液的醋酸乙酯提取物进行抑菌和抗肿瘤活性检测。结果 从水仙根茎共分离到18株内生真菌,各菌株发酵液的醋酸乙酯提取物对4种供试细菌和HepG2细胞都有抑制作用。在质量浓度10 mg/mL时,SX-R202和SX-S102对大肠杆菌和绿脓杆菌抑菌圈直径分别达到18 mm和20 mm;在质量浓度1 mg/mL时,SX-R201、SX-R202、SX-R203和SX-R204对HepG2细胞增殖抑制率分别为（86.0±1.1）%、（89.8±1.3）%、（62.9±0.9）%和（90.6±1.0）%。结合形态学特征和分子生物学鉴定确定SX-R201为尖孢镰刀菌属Fusarium sp. 菌株、SX-R202和SX-R203为青霉属Penicillium sp. 菌株、SX-R204和SX-S102为曲霉属Aspergillus sp. 菌株。结论 水仙内生真菌的抑菌和抗肿瘤效果明显,值得进一步研究。     

不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的比较分析

为探讨不同产地杜仲皮内生真菌种群结构的差异,采用平板分离法分离来自慈利、略阳和遵义3个产地杜仲皮内生真菌,通过形态和分子手段相结合的方式对分离出的真菌进行鉴定,共分离得到152株内生真菌,分属于8个属,其中Phomopsis,Diaporthe,Alternaria为3个产地内生真菌共有属,各产地的优势种群不同。相似性分析表明,不同产地杜仲皮内生真菌的组成结构上存在差异;多样性及均匀度分析表明,慈利和略阳产地杜仲皮内生真菌种群多样性较高,分布较均匀。遵义产地杜仲皮内生真菌种群的多样性指数及均匀度指数最低,优势种群集中,奇异度较高。拟茎点菌属与其有性态间座壳属菌株的系统发育及遗传距离分析,不同产地杜仲皮中拟茎点菌属及其有性态真菌多样性丰富。综合分析认为,杜仲皮组织的内生真菌具有多样性,慈利、遵义和略阳3个产地内生真菌的数量、组成及种群间存在显著差异。     

基于高通量测序研究番红花不同生长期根际土壤中真菌群落结构及多样性

目的 以新疆番红花Crocus sativus L.不同生长期的根际土壤为材料,研究土壤真菌群落结构与多样性。方法 提取番红花不同生长期的根际土壤总DNA,应用Illumina NovaSeq 6000高通量测序平台进行测序分析。结果 对番红花3个生长期[生长初期（S1）、生长中期（S2）、生长后期（S3）]的3组样本进行高通量测序,共获得4252个操作分类单元（OTUs）,包含9个真菌门,并对检测到的真菌属中相对丰度前20的真菌属进行了分析。结果发现,不同生长期番红花优势真菌群落共有门属分别是子囊菌门（Ascomycota）、被孢霉门（Mortierellomycota）、链格孢属（Alternaria）、球腔菌属（Mycosphaerella）和爪甲白癣菌属（Arthrographis）。3个生长期的真菌组成有所不同,S1和S2生长期特有的属分别是平脐蠕孢属（Bipolaris）和谷菌根菌属（Archaeorhizomyces）,S3有2个特有的属和1个特有的门,分别是棘壳孢属（Setophoma）、枝孢属（Cladosporium）和油壶菌门（Olpidiomycota）。Alpha和Beta多样性分析结果表明,不同生长期番红花根际土壤真菌群落赵氏指数（Chao1）、香农指数（Shannon）和观察到的种类数（Sobs）差异有统计学意义,样本中真菌物种组成存在一定差异。结论 利用高通量测序技术可快速、全面地获得土壤真菌组成信息。番红花不同生长时期根际土壤中真菌群落结构与多样性存在差异,菌群多样性随番红花的生长呈现不断上升的趋势;在番红花不同的生长期尤其是S1土壤样本中均检测到相对丰度较高的有害菌链格孢菌属和被孢霉门。为进一步揭示新疆番红花S1易发生种球腐烂病害,以及根际真菌的多样性与番红花球茎内生真菌、病原菌相互作用机制研究提供新思路。     

白花曼陀罗内生真菌多样性及抗皮肤真菌活性分析

目的 分析白花曼陀罗各部位内生真菌的类群结构与多样性,并筛选出具有抗皮肤真菌的活性菌株,为寻找新的抗皮肤真菌先导化合物提供菌株资源。方法 采用组织块法对白花曼陀罗根、茎、叶3个部位的内生真菌进行分离,结合形态学和rDNA-内转录间隔区（ITS）序列分析法对内生真菌进行鉴定,利用琼脂扩散法分析其抗皮肤真菌活性。结果 该研究从白花曼陀罗中分离到292株内生真菌,隶属于34个属,其中根部内生真菌的优势类群为镰刀菌属（Fusarium）占72.97%,茎部以镰刀菌属（37.25%）和Plectosphaerella（28.43%）为主要类群,而炭疽属（Colletotrichum）在叶部的比例最高,达39.66%;叶部内生真菌的分离率（89.23%）,定殖率（84.62%）和多样性指数（1.82）明显高于根（70.48%,70.48%,1.23）和茎（69.39%,68.03%,1.64）。35代表性内生真菌发酵液的抗皮肤真菌活性结果表明,它们对犬小孢子菌,黏性毛孢子菌,红毛癣菌、白色念珠菌等皮肤致病真菌的具有抑制作用的菌株分别占总数的97.14%,71.43%,45.71%,25.71%,其中有6株（17.14%）对4种皮肤致病真菌均具有抑制活性,它们分别是Fusarium sp. R1,Penicillium sp. R5,Aspergillus sp. R7,Metarhizium sp. S18,Diaporthe sp. S19和Glomerella sp. L57。结论 白花曼陀罗内生真菌具有丰富的物种多样性,其中存在较高比例的具抗皮肤真菌活性菌株,为寻找新的抗皮肤真菌药物提供了菌株资源。     

新疆药用阿魏属植物内生真菌的生态分布与多样性

为了探索新疆药用阿魏属植物内生真菌的生态分布与多样性,采用微生物学研究方法与技术,从多伞阿魏、阜康阿魏、大果阿魏、新疆阿魏、里海阿魏及羊食阿魏的根、叶及茎中分离内生真菌;运用形态和分子生物学方法对其进行了鉴定;并使用Shannon-Wiener 多样性指数和Sorenson 系数,分析6种药用阿魏内生真菌的组成、分布、多样性及相似性.分离得到内生真菌337株,分属于38个属,其中,链格孢属、短梗霉属及镰刀菌属为优势菌群;在新疆阿魏中分离得到的内生真菌最多,阜康阿魏根中分离出来的内生真菌Shannon-Wiener多样性指数(H')最大,达到1.85;多伞阿魏叶和新疆阿魏叶的内生真菌菌群相似性最高,相似性系数达到0.75.结果显示,6种新疆药用阿魏植物中皆存在内生真菌;阿魏不同部位内生真菌的分布、多样性及相似性等均存在差异,具有一定的物种及组织专一性;为阿魏属植物内生真菌的深入研究奠定了理论基础.     

白木香内生真菌的分离鉴定及诱导结香作用研究

目的 分离、纯化经通体结香技术诱导的白木香木质部真菌,筛选能够高效促进白木香产生优质沉香的菌株。方法 采用组织块分离法分离、纯化菌株,通过形态学特征结合内转录间隔区（ITS）序列分析鉴定真菌;将真菌菌液接种到白木香树4个月后进行功能验证;依据《中华人民共和国药典》（以下简称《中国药典》）2020年版沉香项下薄层色谱、浸出物含量测定、沉香四醇含量测定及特征图谱方法分析菌株诱导效果。结果 从白木香木质部中分离出48株真菌,优势菌株为镰刀菌;经刺盘孢菌属（Colletotrichum sp.）、黑曲霉Aspergillus niger、渐进绿木霉Trichoderma paraviridescens诱导的沉香薄层色谱斑点与对照药材一致;经镰刀菌属（Fusarium sp.）、黑曲霉、渐进绿木霉诱导的沉香浸出物质量分数均大于10%,与对照组差异有统计学意义（P<0.05）;经可可毛二孢菌Lasiodiplodia theobromae、黑曲霉、渐进绿木霉等6株菌诱导的沉香特征图谱与对照药材一致,沉香四醇质量分数均大于0.1%,与对照组差异有统计学意义（P<0.05）。结论 从白木香木质部分离出的内生真菌可诱导沉香形成,其中黑曲霉和渐进绿木霉能够较快速诱导白木香结香,结香所得的树脂品质符合《中国药典》2020年版标准。     

延胡索不同组织器官中内生真菌菌群结构与多样性分析

目的 明确延胡索Corydalis yanhusuo不同组织器官中内生真菌菌群结构与多样性。方法 通过形态和分子手段相结合的方法对延胡索块茎、叶、茎、根中的内生真菌进行分离、鉴定及菌群结构分析。结果 共分离得到内生真菌2161株,根据菌株的形态学特征划分成106个形态型,分子鉴定为57个分类单元,归属到41个属,其中木霉属Trichoderma、毛链孢属Monilochaetes为块茎的专有属,腐霉属Pythium、白僵菌属Beauveria为叶的专有属,亚球壳属Sphaerulina、核瑚菌属Typhula为茎的专有属,小囊菌属Microascus为根的专有属;相似性分析表明,延胡索不同组织器官内生真菌组成结构上存在差异;Shannon-wiener多样性指数及Simpson指数分析显示延胡索根和茎中内生真菌多样性指数、丰度均显著高于块茎和叶。结论 延胡索组织器官中内生真菌资源丰富,为延胡索内生真菌资源的开发利用提供了基础资料和参考依据。     

六神曲中真菌的分离与鉴定

目的：对传统工艺发酵六神曲中真菌进行分离与鉴定研究。方法：采用平板划线法和菌丝顶端纯化法从传统发酵六神曲分离真菌,使用生物显微镜进行显微形态学鉴定,DNA测序进行分子生物学鉴定。结果：从传统发酵六神曲分离并确定3株真菌分别为曲霉属真菌黄曲霉菌,青霉属真菌产黄青霉菌以及枝孢属真菌枝孢霉菌。黄曲霉菌和产黄青霉菌发酵六神曲气味纯香,表面遍布白衣略有黄衣出现与传统发酵相似;枝孢霉菌发酵六神曲产生霉腐气味,曲块表面暗灰褐色与传统发酵差别大,推测枝孢霉菌为六神曲发酵中产生的杂菌。结论：从传统方法发酵的六神曲分离得到3株真菌,经形态学鉴定及分子生物学鉴定,确定3株真菌分别为曲霉属真菌黄曲霉菌,青霉属真菌产黄青霉菌以及枝孢属真菌枝孢霉菌,为六神曲有效菌群的筛选提供了重要的物质基础研究。     

重楼根际及药用部位内生真菌多样性与群落结构差异分析

目的寻找能促进宿主植物活性代谢产物合成的微生物,为后续功能菌群的建立及功能基因的发掘,提供理论支持。方法应用IlluminaMiseqPE250高通量测序技术对重楼根际土壤真菌、根及根茎内生真菌ITS1区进行序列测定,并进行生物信息学分析。结果测序结果共获得154228条序列,这些序列对应的根际土、根茎、根分别被聚类为408、119、57个OTUs。结论重楼根际及内生真菌多样性的关系为根际土根茎根,在重楼药用部位根茎中发现Mucoromycota门较非药用部位根中的门为特有门,Ascomycota门为优势门,Roseodiscus属真菌为重楼根茎内生真菌优势菌群,根茎和根部的特有种群及优势菌群可能与重楼活性产物合成密切相关。     

射干内生真菌Fusarium proliferatum的ISSR和SRAP位点遗传多样性分析

目的为了解射干内生真菌Fusarium proliferatum的遗传多样性。方法选用了52条ISSR引物和90条SRAP引物对17株射干内生真菌F. proliferatum进行了遗传多样性分析。筛选出了27条ISSR引物和38条SRAP引物可用于遗传多样性分析。结果结果,27条ISSR引物共扩增出了178个条带,其中131条(63%)具有多态性;38条SRAP引物能够扩增出357条稳定性较好的条带,其中323条(91%)具有稳定性差异。27条ISSR引物PCR扩增产物的多态性信息量(PIC)介于0.19～0.91,平均为0.70;38条SRAP引物PCR扩增产物的多态性信息量PIC介于0～0.93,平均为0.73。聚类分析结果表明,根据27个ISSR、38个SRAP及ISSR+SRAP遗传位点分析得出遗传相似系数变化范围分别为0.73～0.99、0.72～0.95和0.73～0.95,平均分别为0.84、0.85和0.85。根据材料间的遗传相似系数聚类,三者之间的聚类有较小的差异,但总体上,17株内生真菌被聚为3大类,分离自根的内生真菌F. proliferatum聚为一类,分离自茎和叶的F. proliferatum聚集于另外两类。研究表明,内生真菌F. proliferatum遗传相似性较大,其亲缘关系较近,与传统方法鉴定出的结果一致。结论采用分子标记技术比传统的方法鉴定更为有效,同时,ISSR和SRAP标记可更真实地反映射干内生真菌F. proliferatum的遗传多样性,为该内生真菌在分子生物技术方面的研究等提供一定参考。     

基于16 S rRNA序列研究华重楼植株可培养内生细菌的多样性

目的分析华重楼Paris polyphylla健株和茎腐病感病植株内生可培养内生细菌的多样性。方法用牛肉膏蛋白胨培养基分离华重楼茎腐病及健康植株根茎、茎、叶等不同部位的细菌,采用16 S rRNA通用引物27F/1492R进行PCR扩增结合DNA测序技术,对分离自华重楼健株及茎腐病植株不同部位的细菌进行初步鉴定。结果从华重楼的健康植株和感病植株中分离到11属23种细菌。从健株分离到4属11种内生细菌,其中根茎、茎、叶分别分离到9、10和5种内生细菌。从病株分离得到10属14种内生细菌,其中根茎、茎、叶分别分离到11、8和3种内生细菌。华重楼健株的根茎部内生细菌量最高,达2.999×105 cfu/g,叶部内生细菌量较低,为7.32×104 cfu/g,华重楼健株根茎、茎、叶中的芽孢杆菌量最高,比例分别为73.3%、67.1%和81.8%。华重楼病株的茎部内生细菌量最高,达2.817×105 cfu/g,叶部内生细菌量较低,为2.76×104 cfu/g,华重楼病株的根茎、茎、叶部的假单胞菌量最高,比例分别为35.6%、50.3%和60.5%。华重楼健株不同部位的多样性指数和均匀度指数均高于病株。结论华重楼健康植株以芽孢杆菌为优势细菌类群,华重楼茎腐病植株以假单胞菌为优势细菌类群。华重楼健株相比病株具有更为丰富的内生细菌群落多样性。     

南方红豆杉内生真菌的分离及抗菌活性筛选研究

 目的 对我国广西产的野生南方红豆杉内生真菌进行分离,并研究其抗菌活性,旨在筛选具有良好抗菌活性的真菌菌株,以寻找新型抗菌物质。 方法 以组织块分离法获得内生真菌,并以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌为实验菌株,用琼脂块法和纸片扩散法对分离的菌株进行抗菌活性筛选。 结果 从南方红豆杉根、茎、叶中共分离到34株内生真菌,其中有8株真菌对至少1种实验菌株有抗菌活性,占总分离菌株的23.53%。 结论 南方红豆杉内生真菌种类多样,而且存在着丰富的抗菌天然活性物质,这可为寻找新型抗菌物质提供可利用的候选菌株。     

铁皮石斛内生真菌的分离及其体外抑菌和抗肿瘤活性初步研究

目的分离铁皮石斛Dendrobium officinale内生真菌,研究内生真菌的分布并初步探讨和筛选具有抑菌和抗肿瘤活性的特异菌株。方法利用组织分离法和分子生物学方法分离、鉴定内生真菌;以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌作为受试对象,采用对峙法和管碟法分别对内生真菌及其发酵代谢产物的醋酸乙酯萃取相进行抑菌实验;采用MTT法对内生真菌代谢产物醋酸乙酯萃取相进行体外抗肿瘤活性检测。结果从铁皮石斛中分离得到28株内生真菌,分子鉴定结果显示,分离的内生真菌归属于10个属,其中镰刀菌属为优势属。抑菌实验结果显示28株内生真菌中,有7株至少能对1种指示菌有抑菌作用,其代谢产物的醋酸乙酯萃取相对3种指示菌和Hep G2细胞具有不同程度的抑制作用。结论铁皮石斛内生真菌种群丰富,从中分离得到的内生真菌具有潜在的抑菌和抗肿瘤活性,为进一步开发抑菌、抗肿瘤候选药物奠定基础。     

北沙参内生真菌的抑菌活性与分类研究

目的研究北沙参内生真菌的抗菌活性,鉴定活性真菌的分类地位。方法采用植物组织分离法从北沙参基原植物珊瑚菜Glehnia littoralis中分离内生真菌。以大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和白色假丝酵母为指示菌株,采用牛津杯法研究北沙参内生真菌的抑菌活性,对具有抑菌活性的内生真菌进行分子鉴定。结果有4株内生真菌对大肠杆菌具有抑制作用,内生真菌发酵浓缩液抑菌圈直径与4 U/mL硫酸庆大霉素抑菌圈直径的比值(d/D)最大可达1.07;有15株内生真菌对金黄色葡萄球菌具有抑制作用,d/D值最大为0.65;有3株内生真菌对白色假丝酵母具有抑制作用,内生真菌发酵浓缩液与0.2 mg/mL氟康唑的d/D值最大可达1.27。19株具有抑菌活性的内生真菌归于4个目,5个科,7个属,8个种。结论北沙参植物中存在多种抑菌活性的内生真菌,对于北沙参内生真菌资源的开发及药材道地性的评价具有一定的指导意义。     

药用植物五味子内生真菌的分离及其抑菌活性研究

 目的研究药用植物五味子内生真菌及其次生代谢产物的抑菌活性,旨在获得有良好抑菌活性的菌株,以寻找新型抗菌物质。方法以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、酿脓链球菌、屎肠球菌、粪肠球菌和白假丝酵母为试验菌株,用菌饼法及纸片法对分离的真菌及其次生代谢产物进行了抑菌实验。结果从药用植物五味子中分离到36株内生真菌,其中有33株内生真菌对指示菌均表现出不同的抑菌活性,占总分离菌株的91.67%;有30株内生真菌的发酵液对指示菌株也有一定的抑制作用,占总分离菌株的83.33%。结论药用植物五味子的内生真菌及其次生代谢产物中存在着丰富的抑菌天然活性物质,这可为寻找新型抗菌物质提供资源。