菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的克隆与原核表达分析＊

目的 克隆菊花脑芳樟醇合酶基因CnTPS1的全长编码序列，利用原核系统表达融合蛋白，为进一步研究该基因在菊花脑萜类合成中的功能提供理论依据。方法 以菊花脑基因组数据为基础，设计特异性引物，PCR扩增CnTPS1的全长编码序列，利用生物信息学分析软件分析序列特征。利用qRT-PCR技术分析CnTPS1基因在不同组织中的基因表达量。构建原核表达载体，体外诱导目的蛋白表达。结果 CnTPS1编码序列全长1749bp，编码582个氨基酸；基因表达模式分析表明该基因在茎和管状花中表达量较高；原核表达系统能诱导出67.58kDa大小的蛋白。结论 首次从菊花脑中克隆得到一个芳樟醇合酶基因CnTPS1，运用生物信息学方法对其编码蛋白的理化性质、结构特征等进行了分析预测，分析了该基因的组织表达模式，并在原核表达系统中成功诱导表达出目标蛋白，这些结果将为菊花脑萜类合酶基因的功能以及萜类物质生物合成途径的解析提供理论依据。     

鬼针草及其近缘种的分子鉴定和亲缘关系研究

目的 构建鬼针草Bidens pilosa及其与近缘种之间系统发育关系,准确鉴别鬼针草及其近缘种。方法 提取鬼针草及其近缘种DNA,对核基因ITS片段和叶绿体基因psbA-trnH序列扩增和测序,计算物种种内、种间Kimura 2-parameter （K2P）遗传距离。采用最近距离、相似性搜索、构建Neighbor-joining（NJ）系统聚类树3种方法进行鉴定分析。结果 ITS和psbA-trnH分子系统树支持鬼针草不同居群样本聚为一单系分支,支持率为79%和87%;其中,鬼针草与白花鬼针草构成一单系分支,金盏银盘与婆婆针构成姐妹群分支,上述两分支ITS和联合数据支持率均为100%;狼把草与柳叶鬼针草、大狼把草构成一单系分支（ITS和联合数据支持率为100%,psbA-trnH数据支持率为96%）。鬼针草及其近缘种种间ITS和psbA-trnH序列的遗传距离为0.007 94～0.128 80和0.005 18～0.074 52,均远大于鬼针草种内遗传距离0～0.001 59和0～0.002 52。结论 鬼针草与白花鬼针草亲缘关系最近,金盏银盘与婆婆针构成姐妹群关系,狼把草与柳叶鬼针草、大狼把草亲缘关系较近。ITS和psbA-trnH序列可以准确鉴别鬼针草及其近缘种。     

滇龙胆GrGPPS基因的克隆及其序列分析与原核表达

目的 从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆单萜化合物合成的关键酶牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GrGPPS,进行序列特征分析和原核表达。方法 根据三年生滇龙胆转录组GrGPPS基因序列,设计特异性引物,通过RT-PCR扩增得到GrGPPS cDNA序列,并进行TA克隆、测序及序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrGPPS,转入Escherichia coli Rosetta（DE3）中,在37℃、1.0 mmol/L IPTG诱导下进行表达。结果 GrGPPS cDNA全长1 107 bp,编码369个氨基酸;序列分析表明,GrGPPS基因是异戊烯基合成酶家族的成员;氨基酸序列系统发育分析表明,GrGPPS与金鱼草AmGPPS亲缘关系最近;构建pGEX-4T-1-GrGPPS重组质粒,获得稳定的pGEX-4T-1-GrGPPS原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论 克隆了GrGPPS基因,建立pGEX-4T-1-GrGPPS稳定的原核表达体系,为进一步纯化和鉴定GPPS蛋白并研究其结构和功能奠定基础。     

缬草水提取物的化学成分研究

目的 对缬草Valeriana officinalis水提取物中的化学成分进行研究。方法 运用正相硅胶柱色谱、ODS反相柱色谱、制备高效液相色谱等分离手段进行分离纯化,采用核磁共振、质谱等多种波谱学技术鉴定化合物的化学结构,并采用Griess法评价其对脂多糖诱导的小胶质细胞BV-2神经炎症的抑制活性。结果 从缬草水提取物中分离得到了12个化合物,分别为tinnevellin-8-O-β-D-glucopyranoside（1）、大黄素-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（2）、(2R,3S)-肥牛木素（3）、左旋橄榄素-9''-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（4）、左旋马尾松树脂醇-3a-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（5）、金色酰胺醇乙酸酯（6）、松脂素（7）、8-羟基松脂素（8）、松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（9）、8,8''-二羟基松脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（10）、(2S)-橙皮苷（11）和香蜂草苷（12）。结论化合物1～4和6均为首次从缬草属植物中分离得到。其中,化合物3～4、6、9、11～12在不影响BV-2的细胞活力前提下,可以抑制脂多糖诱导的BV-2细胞神经炎性因子一氧化氮（NO）的产生。     

苦荞类黄酮3’-羟化酶基因的克隆及其冷胁迫下的组织表达

目的 克隆苦荞Fagopyrum tataricum类黄酮3’-羟化酶（flavonoid 3’-hydroxylase,F3’H）基因全长cDNA序列,对该基因进行序列分析和原核表达,以及冷胁迫条件下该基因表达量和花青素定量测定。方法 采用同源克隆和RACE技术从苦荞花蕾中克隆苦荞F3’H（FtF3’H）;构建FtF3’H原核表达载体pET-30b （+）-FtF3’H,在大肠杆菌BL21（DE3）中进行诱导表达;采用半定量RT-PCR分析FtF3’H基因在冷胁迫下芽期苦荞不同组织的表达量,并采用分光光度计法测量花青素量。结果 苦荞FtF3’H基因含有一个1 470 bp的ORF,编码489个氨基酸,编码蛋白属于细胞色素P450家族;SDS-PAGE分析表明,目的蛋白相对分子质量54 000;芽期苦荞冷胁迫处理前后子叶和胚轴中FtF3’H表达量以及花青素量的变化分析表明,冷胁迫显著增强了FtF3’H的表达和花青素的积累（P<0.05）。结论 成功克隆FtF3’H基因,并实现了FtF3’H基因的异源表达;芽期苦荞在冷胁迫下,可能通过提高FtF3’H基因表达量进而促进花青素的合成,参与其抗逆生理过程。     

白芍中1个新的单萜苷化合物

目的 对白芍进行化学成分研究。方法 综合应用多种现代色谱分离技术进行系统的分离和纯化，根据化合物的理化性质和核磁共振波谱数据进行结构鉴定。结果 从白芍65%乙醇提取物中分离得到11个化合物，分别鉴定为（4S）-紫苏酸α-L-阿拉伯糖基-（1''→6''）-β-D-葡萄糖苷（1）、4，9-二羟基-8，10-去氢百里香酚-1-O-β-D-葡萄糖苷（2）、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（3）、白藜芦醇（4）、苯甲酸葡萄糖苷（5）、猫儿刺酚苷A（6）、儿茶素（7）、没食子酸甲酯（8）、没食子酸乙酯（9）、3-甲氧基没食子酸（10）、1，2，3，4，6-O-五没食子酰葡萄糖苷（11）。结论 化合物1为新化合物，命名为紫苏酸苷；化合物2和5为首次从芍药属植物中分离得到。     

洋金花叶化学成分研究（I）

目的 研究洋金花Datura metel 叶的化学成分。方法 应用乙醇提取洋金花叶,采用硅胶、AB-8大孔吸附树脂、ODS和Sephadex LH-20等柱色谱以及制备液相等技术分离纯化化合物,根据理化性质及波谱数据进行结构鉴定。结果 从洋金花叶中分离得到14个化合物,分别鉴定为naphthisoxazol A（1）、刺龙芽糖苷I（2）、L-色氨酸（3）、槲皮素3-O-2-(E-咖啡酸)-α-L-阿拉伯糖-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖-7-O-β-D-葡萄糖苷（4）、正丁基-O-α-D-呋喃果糖苷（5）、金线莲碱（6）、二氢催吐萝芙木醇-O-β-D-葡萄糖苷（7）、(6S, 7E, 9S)-9-[(β-D-glucopyranosyl)-oxy] megastigma-4, 7-dien-3-one（8）、山柰酚-3, 7-二- O-β-D-吡喃葡萄糖苷（9）、山柰酚-7-O-β-D-葡萄糖苷（10）、槲皮素-7-O-葡萄糖苷（11）、(6S, 9R)-6-羟基-3-酮-α-紫罗兰醇-9-O-β-D-葡萄吡喃糖苷（12）、豆甾醇（13）、豆甾醇-3-O-β-D-葡萄糖苷（14）。结论 化合物1～8为首次从茄科中分离得到。     

鸢尾糖基转移酶ItUGT797基因的克隆与表达分析＊

目的 对川射干（Iris tectorum Maxim.）中可能参与黄酮类化合物生物合成的糖基转移酶基因ItUGT797展开初步研究，解析ItUGT797编码蛋白的各项生物信息指标并优化其原核表达体系。方法 提取鸢尾各组织部位的RNA并进行反转录获得cDNA文库，根据鸢尾转录组中ItUGT797基因序列设计基因特异性引物，通过同源克隆的方法构建pET-32a （+）-ItUGT797原核表达重组载体。使用各类生物信息学网站对测序后的ItUGT797序列进行理化性质、蛋白结构和进化关系等分析；实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR）验证基因在各部位的表达情况；蛋白体外表达情况则使用大肠杆菌体系检测。结果 ItUGT797开放阅读框长度为1455 bp，编码蛋白分子量大小分别为53.80 kDa。ItUGT797在各组织中表达情况为花>叶>根茎。系统发育进化树表明，ItUGT797可能是具有7-O-糖基化活性的糖基转移酶。原核表达结果显示在诱导剂IPTG为0.1mM时，ItUGT797能够表达出较多的可溶性蛋白。结论 本研究成功从鸢尾中克隆了ItUGT797基因，并分析了其编码蛋白的特征，检测了基因在根茎、叶和花中的表达量，同时通过原核表达体系筛选出最适合该基因可溶性蛋白表达的诱导剂浓度，为后续探索其参与鸢尾中黄酮类成分生物合成的功能奠定理论基础。     

川白芷根极性化学成分研究

该文研究川白芷Angelica dahurica var. formosana cv. Chuanbaizhi根极性化学成分。采用硅胶和高效液相等柱色谱方法进行分离纯化,通过化合物的谱学数据鉴定其结构。共分离得到14个化合物,分别鉴定为叔-O-β-D-吡喃葡萄糖基-(R)-白当归素(1)、(2"S)-3"-O-β-D-吡喃葡萄糖基水合氧化前胡内酯(2)、印枳苷(3)、仲-O-β-D-吡喃葡萄糖基白当归素(4)、异秦皮定-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(5)、苄基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(6)、花椒毒酚-8-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(7)、异戊烯基-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(8)、东莨菪苷(9)、(2'R)-5'-羟基印枳苷元-5'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷(10)、(2'S,3'R)-3'-羟基印枳苷(11)、茵芋苷(12)、苄基-O-β-D-呋喃芹糖基-(1"→6')-β-D-吡喃葡萄糖苷(13)和前胡苷Ⅳ(14)。其中,化合物 2,5,6,8,10~13 等8个化合物为首次从川白芷根中分离得到。     

垂序商陆PaAACT基因克隆和表达分析

目的:从垂序商陆根中克隆了商陆皂苷甲生物合成过程中关键酶乙酰乙酰辅酶A转移酶(acetoacetyl-CoA transferase,AACT)基因,进行生物信息学分析和原核表达。方法:提取垂序商陆根的总RNA,然后逆转录合成c DNA,在分析垂序商陆转录组数据的基础上,设计Pa AACT基因的特异性引物,聚合酶链式反应(PCR)扩增Pa AACT基因的c DNA序列,通过构建原核表达载体p ET-32a-PaAACT,诱导表达并且纯化目的蛋白。结果:Pa AACT基因开放阅读框为1 254 bp,编码417个氨基酸。生物信息学分析显示Pa AACT蛋白的分子式为C1 914H3 120N538O576S17,推测其相对分子质量为43. 43 k Da,理论等电点8. 90,不稳定系数32. 27,属于稳定蛋白质。根据生物信息学分析结果,Pa AACT蛋白属于硫解酶家族成员,在C末端含有硫解酶家族的1个保守位点和1个活性位点。Pa AACT蛋白可能位于细胞质中、不含信号肽、没有跨膜区。系统进化分析显示Pa AACT蛋白与甜菜等廖科植物AACT蛋白亲缘关系较近。经IPTG诱导,在大肠埃希菌BL21 (DE3)菌株中表达了Pa AACT重组蛋白,利用Ni2+亲和色谱获得了纯化的目的蛋白。结论:该研究从垂序商陆中克隆Pa AACT基因,为下一步测定Pa AACT酶催化活性、制备抗体奠定基础,也为研究其在商陆皂苷甲生物合成途径中的作用提供理论依据。     

中国红豆杉TcAPLs基因的克隆及表达分析

目的克隆中国红豆杉altered phloem development(APL)基因,研究APL在中国红豆杉剥皮后树皮再生过程中的表达状况,以揭示其可能的调控作用机制。方法利用反转录PCR(RT-PCR)方法克隆得到3个中国红豆杉APL(TcAPLs)基因的cDNA全长序列,分别命名为TcAPL1、TcAPL2和TcAPL3,进一步利用生物信息学工具对其进行分析,最后利用半定量RT-PCR对中国红豆杉不同组织和qRT-PCR技术对其剥皮再生不同时期的TcAPLs进行表达分析。结果系统进化树结果显示,TcAPL1与TcAPL2编码的蛋白与川桑的APL蛋白亲缘关系最近,聚为一类;TcAPL3处在APL另一个大的独立分支上。组织表达谱分析表明TcAPL1和TcAPL22个基因主要在根、茎、叶片和韧皮部(含形成层)中均高表达;TcAPL3在叶片中表达量较高,而在根和木质部(含形成层)表达较低。在中国红豆杉剥皮再生过程中,TcAPL1和TcAPL22个基因的表达水平随着时间的延长表现为先上升后下降的趋势,均在36 d下降最明显;TcAPL3的表达则在整个组织再生过程中被抑制。结论克隆了3个TcALs基因,3个基因在中国红豆杉剥皮再生过程中均有响应,推测它们在中国红豆杉植物剥皮后组织再生中起一定的调控作用。     

黄花蒿MCS基因的克隆及其序列分析与原核表达

目的 从黄花蒿中克隆MEP途径关键酶2C-甲基-D-赤藓糖醇-2,4-环焦磷酸合成酶(MCS)基因,进行序列特征分析、原核表达以及组织表达的研究.方法 根据黄花蒿MCS (AaMCS)基因EST序列,克隆MCS cDNA及基因组序列.将MCS编码区与表达载体pET-21a(+)重组,构建pET-21a (+)-MCS的原核表达载体并转入大肠杆菌BL21 (DE3),IPTG诱导获得MCS融合蛋白.半定量RT-PCR检测MCS的组织表达情况.结果 AaMCS cDNA全长994 bp,包含681 bp的开放阅读框,编码226个氨基酸,基因全长2 540 bp,包含3个外显子和2个内含子.构建pET-21a (+)-MCS重组质粒,获得稳定的pET-21a (+)-MCS原核表达体系.AaMCS在根、茎、叶、花中均有表达,其中花中表达量较高,根和茎中表达量低.结论 克隆了AaMCS基因,建立pET-2 1a (+)-MCS稳定的原核表达体系,为研究AaMCS蛋白的活性及其功能奠定了基础.     

当归抽薹开花过程中赤霉素代谢水平及其关键酶基因克隆与表达分析

目的 对当归Angelica sinensis 16个赤霉素（gibberellins,GAs）进行含量测定、GAs代谢酶基因筛选并进行生物信息学分析、关键基因克隆及表达验证,以期为调控当归抽薹开花提供理论依据。方法 利用HPLC-MS/MS对不同材料中GAs含量进行测定与分析,基于当归全长转录组筛选直接参与GAs代谢酶基因,利用在线工具进行生物信息学分析,并对关键酶基因GA2ox6和GA20ox1表达水平进行q RT-PCR检测。结果 在所测定的16个GAs中,8个GAs含量在早薹植株中高于非早薹植株,13个GAs含量随植株发育时期延长逐渐增加。当归全长转录组中含有9个直接参与GAs代谢的酶基因,可分为6个亚家族,共含有6个保守基序,亚细胞定位于细胞质。GA2ox6和GA20ox1基因克隆片段由于插入序列与全长转录组测序片段存在长度差异。GA2ox6基因在抽薹植株、随种苗春化作用和植株发育时期延长呈现低表达,而在冷冻规避春化作用种苗中呈现高表达,GA20ox1基因则相反;GA2ox6和GA20ox1基因在叶和茎中相对于根均呈现高表达。结论 当归含有9个直接参与GAs代谢的酶基因,各成...     

青天葵中SKP1同源基因的克隆及原核表达

目的从青天葵Nervilia fordii克隆SKP1的同源基因NSKs,并对编码的蛋白进行生物信息学分析及原核表达,为了深入研究青天葵中SCF复合体的功能奠定基础。方法从青天葵转录组中筛选得到5条SKP1同源基因序列(NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11),构建pGEX-4T-NSKs原核表达载体于大肠杆菌Rosetta (DE3)中诱导表达GST-NSKs融合蛋白并进行纯化。结果 NSK2、NSK3、NSK5、NSK7、NSK11的开放阅读框(ORF)分别为495、483、489、498和486 bp,编码164、160、162、165和161个氨基酸,蛋白相似性达到73.65%,均属于SKP1蛋白家族,具F-box和Cullin蛋白结合位点。亚细胞定位预测NSK2、NSK3和NSK5定位于细胞核,而NSK7和NSK11定位于细胞质和细胞核。系统进化树结果表明,NSK2、NSK3和NSK5聚为一簇,与小麦和玉米等的同源性较高;NSK7和NSK11聚为一簇,与多头绒泡菌的同源性较高。通过构建原核表达载体,确定了在大肠杆菌Rosetta (DE3)中的有利诱导条件,成功诱导表达并纯化得到5个GST-NSKs重组蛋白。结论成功克隆5个SKP1同源基因NSKs,获得NSKs蛋白,为深入研究青天葵中SCF复合体的功能提供了一定的基础。     

鸢尾糖基转移酶编码基因ItUGT349和ItUGT419克隆及特性研究

目的 克隆获得鸢尾Iris tectorum糖基转移酶基因ItUGT349和ItUGT419,并对其进行生物信息学分析、基因差异表达检测和蛋白原核表达等特性分析。方法 以鸢尾转录组中筛选到的ItUGTs基因全长开放阅读框(open reading frame,ORF)设计特异性引物,进行PCR扩增,经测序后获得基因序列并进行生物信息学分析;通过荧光定量PCR(real-time PCR,qRT-PCR)进行基因差异表达检测;最后构建pET-32a(+)原核表达载体在大肠杆菌中表达蛋白。结果 PCR扩增ItUGT349和ItUGT419的ORF长度分别为1461、1488 bp,编码蛋白相对分子质量大小分别为53 830、54 910。荧光定量PCR显示,ItUGT349的表达量在叶片中最高,而ItUGT419在花器官中表达最高。进化树表明,ItUGT419与三萜类糖基转移酶聚类在一起,ItUGT349与三萜、黄酮和木质素等多种类型的糖基转移酶聚类到一支。ItUGT349和ItUGT419在大肠杆菌中均成功的表达出可溶性蛋白。结论 通过ItUGT349和ItUGT419基因全长ORF克隆,并对其进行序列分析,基因差异表达检测及原核表达等研究,为后续进一步鉴定其催化功能奠定基础。     

当归MADS-box生物信息学及SOC1克隆与表达分析

目的 对当归Angelica sinensis MADS-box基因家族进行筛选与生物信息学分析,并对SOC1-4基因进行克隆与表达验证。方法 基于当归全长转录组筛选MADS-box基因家族,利用在线工具进行生物信息学分析,并利用q RT-PCR检测SOC1-4基因在不同材料中的表达水平。结果 当归全长转录组中含有29个MADS-box基因家族成员,可分为10个亚家族,共含有6个保守基序,蛋白质序列长度为49～422 aa,相对分子质量为5 697.56～49 624.90,等电点为5.06～11.00,亚细胞结果显示当归MADS-box基因家族成员分别定位于叶绿体、细胞核、细胞质和线粒体,二级结构预测及3D建模显示同一亚家族结构相似;SOC1-4基因克隆片段与全长转录组测序结果一致;SOC1-4基因随种苗春化作用和植株发育时期延长呈现高表达,在抽薹植株、茎和叶中高表达,而在冷冻规避春化作用种苗中呈现低表达。结论 当归含有29个MADS-box成员,各成员理化性质和结构存在一定的差异,SOC1-4基因表达水平与当归抽薹开花生理调控一致,为当归MADS-box基因家族调控抽薹开花相关研究...     

西伯利亚白刺L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶基因克隆与序列分析

目的 克隆西伯利亚白刺Nitraria sibirica维生素C合成过程中L-半乳糖-1-磷酸磷酸酶（L-galactose-1-phosphate phosphatase,GPP）编码基因。方法 利用生物信息学方法对西伯利亚白刺三代转录组数据进行分析,共鉴定出2个GPP基因,并从西伯利亚白刺中成功克隆得到2条NsGPP基因序列,进一步利用生物信息学方法对其理化性质、蛋白结构、保守序列以及系统进化等进行分析,并结合RNA-seq数据分析其在盐胁迫下的表达模式,利用qRT-PCR实验检测其在不同组织中的表达水平。结果 从西伯利亚白刺中成功鉴定克隆出2个NsGPP基因,2个NsGPP基因所编码蛋白均含有保守的FBPase/IMPase/glpX-like（FIG）结构域,且与其他植物GPP蛋白具有较高的相似性。利用多个物种的GPP蛋白序列构建系统进化树,结果显示西伯利亚白刺与灌木或半木质化草本植物亲缘关系更近。Motif分析发现NsGPP蛋白与拟南芥等GPP蛋白较为相似,但也存在差异,并且2个NsGPP蛋白之间也存在差异。此外,NsGPP1与NsGPP2的蛋白三维结构之间也存在微小差别。RNA-seq分析表明,不同浓度NaCl处理下,NsGPP1的表达逐步升高的趋势,而NsGPP2的表达量则较低,且在盐胁迫后其表达水平逐渐降低。qRT-PCR实验结果显示,白刺GPP基因的表达存在组织表达特异性,且在同一组织中NsGPP1的表达水平显著高于NsGPP2。结论 从西伯利亚白刺中成功克隆到2个NsGPP基因,其编码蛋白均含有保守的FIG结构域,且与拟南芥等草本植物的GPP蛋白更为相似。NsGPP基因在不同组织中表达水平具有显著差异,其中NsGPP1可能参与西伯利亚白刺维生素C生物合成并参与白刺抵抗盐胁迫。为进一步解析白刺维生素C生物合成以及耐盐分子机制提供了理论依据。     

滇重楼鲨烯环氧酶基因的克隆及原核表达研究

目的克隆滇重楼Paris polyphylla var.yunnanensis三萜皂苷生物合成途径中的关键酶鲨烯环氧酶(squalene epoxidase,SE)基因,并进行原核表达。并用Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1基因和SE2基因的相对量。方法以滇重楼根为材料提取总RNA并反转录为cDNA。以cDNA为模板,根据转录组数据中的2组SE基因全长序列设计特异性引物,对SE基因进行克隆后转入到pEASY-T1 Simple Cloning Vector中,经测序鉴定正确后,构建pEASY-E1-SE表达载体,利用Art Media protein Expression/Amp+培养基自动诱导表达。Real-time PCR法检测cDNA样本中SE1和SE2基因的相对量。结果获得了2条滇重楼SE基因,命名为ppSE1和ppSE2。ppSE1的全长为1 932 bp,开放阅读框(ORF)为1 578 bp,编码525个AA;ppSE2的全长为1 828 bp,ORF长为1 548 bp,编码515个氨基酸。荧光定量PCR结果显示ppSE1基因和ppSE2基因在茎和叶中的表达具有显著差异,ppSE1的表达在叶中最为显著。酶切和测序结果表明,原核表达载体pEASY-E1-SE构建成功;SDS-PAGE分析显示,在BL21(DE3)表达感受态细胞中成功诱导表达了SE基因的2种融合蛋白。结论克隆了滇重楼的SE基因,获得了在体外具有生物学活性的SE蛋白。ppSE1基因和ppSE2基因在滇重楼中具有不同的表达模式,在滇重楼次生代谢产物的合成中起着不同的作用。     

滇龙胆1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR的克隆、序列分析与原核表达

目的从滇龙胆Gentiana rigescens幼叶中克隆萜类合成关键酶1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶基因GrDXR,进行序列分析和原核表达。方法根据滇龙胆转录组中GrDXR基因序列,设计引物,通过RT-PCR扩增得到GrDXR开放阅读框(ORF)序列,并进行TA克隆、测序和序列分析;构建原核表达载体pGEX-4T-1-GrDXR,转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,在IPTG诱导下进行表达。结果 GrDXR ORF全长1 425 bp,编码474个氨基酸。序列分析表明,GrDXR基因是DXR家族成员;蛋白质序列系统发育分析表明,GrDXR与萝芙木RvDXR、橡胶树HbDXR和长春花CrDXR亲缘关系较近。构建pGEX-4T-1-GrDXR重组质粒,获得稳定的原核表达体系。SDS-PAGE结果表明所表达蛋白与预期蛋白大小一致。结论克隆了GrDXR基因,建立其稳定的原核表达体系,为进一步纯化GrDXR蛋白,研究其结构和功能奠定基础。