染色体脆性位点抑癌基因FHIT真核表达质粒的构建

目的构建人染色体脆性位点抑癌基因FHIT真核表达质粒。方法以通过全基因合成的FHIT cDNA为模版,用PCR技术扩增,扩增片段用BamHI/Xho I双酶切后克隆到真核表达载体pcDNA3.1中,用DNA测序法鉴定重组质粒。结果质粒DNA测序显示与文献报道的人FHIT cDNA序列一致。结论成功构建出含人FHIT基因的真核表达质粒。     

小鼠烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1基因的克隆与表达检测

目的 检测真核表达克隆pcDNA3.1烟酰胺单核苷酸腺苷酰转移酶1(NMNAT1)的水平和有效性.方法 采用PCR的方法钓取小鼠源NMNAT1基因的cds全长片段,构建到T载体中,并转接到pcDNA3.1中;同时设计引物进行全基因测序;采用常规的脂质体转染方法转染入Hela细胞系中表达小鼠源NMNAT1基因,通过qPCR和Western blot的方法检测克隆pcDNA3.1-NMNAT1的表达水平和表达有效性,并同时建立小鼠源NMNAT1基因的qPCR和Western blot检测方法.结果 成功钓取了小鼠源NMNAT1基因,测序结果显示与数据库序列完全匹配,pcDNA3.1-NMNAT1通过脂质体转染入Hela细胞系,48 h以后收取细胞,经过反转录以后进行qPCR检测和Western blot检测,结果显示表达克隆pCDNA3.1-NMNAT1能同时在mRNA水平和蛋白水平高表达小鼠NMNAT1基因.结论 成功从小鼠脑cDNA文库中克隆了NMNAT1基因的全长cDNA,与Pubmed序列完全一致,并构建到真核表达载体上正确表达NMNAT1蛋白质.     

人T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体的构建和生物信息学分析

目的：构建T细胞免疫球蛋白黏蛋白-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并对TIM-3基因进行生物信息学分析。方法：采用Trizol法从人外周血单个核细胞提取总mRNA,利用两步法RT-PCR技术扩增TIM-3及其胞外（结构）域基因片段和人IgG1Fc基因片段。并将他们分别克隆到真核表达载体pcDNA3.1（＋）中,通过PCR及测序进行鉴定。序列分析后将TIM-3胞外（结构）域基因片段亚克隆到已经克隆了人IgG1Fc基因片段真核表达载体pcDAN3.1（＋）上;并通过PCR及双酶切进行鉴定。应用生物信息学初步分析TIM-3基因的物理化学性质、蛋白质结构域、功能。结果：成功从PBMC中提取并逆转录的cDNA扩增出TIM-3及其胞外（结构）域基因和人IgG1Fc基因;经PCR、酶切鉴定、测序分析表明它们与GenBank提供的序列信息完全相同。生物信息学分析结果表明TIM-3蛋白为稳定亲水性蛋白,有1个跨膜螺旋结构,相对分子量是33.4KD,等电点pI为5.54。该蛋白含约32.56%的α-螺旋,8.27%的延伸链,49.17%的不规则卷曲,1段21个氨基酸组成的信号肽。TIM-3蛋白亚细胞定位于内质网、高尔基体、液泡、细胞膜上。功能分析预测TIM-3蛋白具有受体和信号转导功能。结论：成功构建TIM-3基因及其融合蛋白真核表达载体,并利用生物分析软件对其进行生物信息学分析。了解TIM-3基因的性质特征,为进一步研究该基因奠定基础。     

日本血吸虫大陆株粘蛋白样蛋白部分基因的克隆

目的构建日本血吸虫中国大陆株粘蛋白样蛋白(SjMLP)核酸疫苗。方法分子克隆常规操作将扩增产物 SjMLP 编码区基因序列克隆至载体 pUCm-T 中,然后亚克隆到真核表达载体 pcDNA3.1( )中。结果经酶切、PCR 及测序鉴定表明所构建的质粒 pUCm-T/SjMLP 和 pcDNA3.1( )/SjMLP 中含有所扩增的基因序列。结论成功地构建了含目的基因的真核表达质粒 pcDNA3.1( )/SjMLP,从而,为进一步对其进行 DNA 免疫系列研究工作奠定了基础。     

胃癌相关基因GCRG213正反义真核表达载体的构建及鉴定

目的:构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体．方法:从pGEM-T质粒上扩增出的胃癌相关基因GCRG213的DNA片段,两端分别引入限制性内切酶KpnI,BamHI和EcoRI, BamHI识别位点．按正向、反向克隆入真核表达载体pcDNA3．1( )．测序正确的重组子pcDNA3．1-a(含GCRG213正向克隆), pcDNA3．1-b(含GCRG213反向克隆)和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞, G418筛选获得稳定转染的细胞株,采用半定量RT-PCR及Wlestern blot比较转染不同质粒的 MKN45细胞中GCRG213在mRNA和蛋白质水平上的表达差异．结果:经测序证实,GCRG213正向克隆和反向克隆正确插入真核表达载体 pcDNA3．1( ),组成重组子pcDNA3．1-a(含正向克隆),pcDNA3．1-b(含反向克隆)．重组子 pcDNA3．1-a,pcDNA3．1-b和空载体经脂质体转染人胃癌细胞系MKN45细胞,G418筛选获得稳定转染的细胞株．与对应的空载体比较,RT-PCR结果显示转染pcDNA3．1-a的 MKN45细胞中其mRNA的表达上调35．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中其mRNA 的表达下调32．1％;Western blot结果显示转染 pcDNA3．1-a的MKN45细胞中其蛋白的表达上调49．4％,而转染pcDNA3．1-b的MKN45细胞中其蛋白的表达下调50．3％．结论:成功构建胃癌相关基因GCRG213正、反义真核表达载体．     

人ACE2基因真核表达载体的构建及其转染人内皮细胞的研究

目的:克隆人血管紧张素转换酶2(ACE2)基因,构建其真核表达载体并将之转染入体外培养的人血管内皮细胞中。方法:采用PCR方法从人胎儿心脏cDNA文库扩增出人ACE2cDNA全长基因,克隆到pcDNA3.1-D/V5-His表达载体上,构建重组真核表达质粒phACE2,经酶切和测序鉴定。采用脂质体法将phACE2转染至人血管内皮细胞中,分别利用实时定量PCR和Western印迹检测重组ACE2的mRNA和蛋白的表达情况。结果:经PCR、酶切和基因序列测定证实重组入载体的片段(2419bp)为目的基因序列,在转染的内皮细胞中发现ACE2的mRNA和蛋白的表达明显增加(P<0.01)。结论:本研究成功构建并表达了pcDNA3.1-hACE2重组真核表达载体,为该基因在高血压病防治中的功效研究奠定了基础。     

日本血吸虫再感染相关蛋白基因的克隆和原核表达

目的　从日本血吸虫 (S .japonicum )尾蚴文库扩增S .japonicum再感染相关蛋白 (RIRP)基因 ,进行克隆并原核表达出RIRP ,为进一步的功能研究奠定基础。　方法　根据已登陆的S .japonicum成虫期RIRP基因的序列设计两条特异引物 ,以S .japonicum尾蚴cDNA文库为模板扩增RIRP基因cDNA ,将该基因的cDNA克隆入原核表达载体 pGEX 4T 1和真核载体 pcD NA3 .1。转化的克隆通过氨苄青霉素的筛选、PCR扩增、双酶切和最后的测序鉴定。重组的 pGEX 4T 1/RIRP在大肠埃希菌BL2 1(DE3 )中进行表达。SDS PAGE鉴定其在大肠埃希菌中的表达情况和分子质量。用抗 2 6kuGST单抗作western杂交进一步鉴定融合蛋白的表达。　结果　从S .japonicum尾蚴文库中扩增出一条长为 462bp的cDNA片段 ,经测序证实其为RIRP基因的全长cDNA。它编码含 15 3个氨基酸的蛋白质—RIRP ,预测其分子质量单位为 17.5 45ku。RIRPcDNA已被成功克隆入 pGEX 4T 1和pcDNA3 .1载体 ,大肠埃希菌BL2 1(DE3 )编码一个约 17ku的蛋白质。　结论　RIRP基因首次从S .japonicum尾蚴文库中扩增出来 ,并成功构建了原核和真核表达载体 ,而且 ,它首次由大肠埃希菌表达 ,表达蛋白的分子质量单位约 17ku。     

细粒棘球蚴95(Eg95)抗原基因的克隆及真核表达质粒的构建

目的　克隆Eg95抗原基因 ,构建携带目的基因的真核表达载体 ,为细粒棘球蚴DNA疫苗的研究提供材料。方法　应用PCR方法从细粒棘球蚴cDNA文库中克隆获得Eg95抗原基因 ,将其克隆至 pUCm -T载体 ,测序确定其正确性。利用定向克隆技术将Eg95抗原基因片段克隆至真核表达质粒pcDNA3上 ,根据选择标记的氨苄抗性基因筛选到阳性克隆 ,通过酶切分析和PCR鉴定筛选出阳性克隆 ,测序确定序列。结果　测序表明所选 pcDNA3-Eg95阳性克隆均为正确连接Eg95抗原基因的重组质粒 ,可以作为DNA疫苗作进一步的研究。结论　成功构建真核细胞表达载体 pcDNA3-Eg95。     

大鼠源肺孢子菌p55基因片段真核表达质粒的构建及表达

目的构建大鼠源肺孢子菌抗原p55基因片段真核表达质粒,并研究该质粒在真核细胞COS-7中的有效表达。方法以含有p55全长基因的质粒为模板,通过PCR扩增p55基因片段,克隆至pGEM-T载体中,经酶切后再将p55基因重组至真核表达载体pcDNA3.1(+)中,构建重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,经限制性内切酶酶切分析及测序鉴定正确后,应用脂质体转染技术转染入COS-7细胞,RT-PCR检测其基因转录情况,SDS-PAGE鉴定其表达相应的目的蛋白质情况。结果成功扩增了p55基因片段,酶切和测序证明正确构建了重组真核表达质粒pcDNA3.1(+)-582,RT-PCR和SDS-PAGE方法证实该片段能在COS-7细胞中有效表达目的蛋白质。结论成功构建了大鼠源肺孢子菌p55基因片段的真核表达质粒载体,并在COS-7细胞中表达,为进一步进行核酸疫苗的研究奠定了基础。     

结核分支杆菌ESAT-6真核表达质粒的构建及蛋白表达的鉴定

目的 用6kDa早期分泌性抗原靶蛋白(ESAT-6)基因构建真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-ESAT-6，并鉴定其在真核细胞(COS-7)中的蛋白表达。方法 以结核杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，用PCR对ESAT-6基因进行扩增，将扩增的产物连接于测序载体pUCm—T上，经测序反应确定无误后，再将PCR反应产物克隆于真核表达载体pcDNA3．1( )上。并用脂质体介导真核表达重组质粒pcDNA3．1( )-ESAT-6转染真核细胞COS-7，72h后，通过SDS—PAGE和免疫印迹鉴定ESAT-6基因表达的蛋白。结果 用结核杆菌基因ESAT-6构建重组真核表达质粒pcDNA3．1( )-ESAT-成功，通过SDS—PAGE证明重组质粒转化的细胞内有一分子量6kDa的特异蛋白，免疫印迹证明该6kDa蛋白能与抗ESAT-6单克隆抗体反应。结论 结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6真核表达重组质粒成功构建，该质粒转染的细胞能够产生、分泌结核杆菌早期分泌性蛋白ESAT-6。