腺病毒相关病毒载体介导人β2肾上腺素能受体、增强型绿色荧光蛋白基因导入心肌细胞的表达

目的探讨充血性心力衰竭(心衰)及其他心脏疾病的基因治疗途径.方法构建携带人β2肾上腺素能受体(β2-AR)和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)双基因的腺病毒相关病毒(adeno-associatedvirus,AAV)载体,感染大鼠的心肌细胞,检测心肌细胞β2-AR、EGFP的表达及环腺苷酸(cAMP)的含量.结果Northern印迹杂交显示感染的心肌细胞表达人β2-ARmRNA;Western免疫印迹杂交分析表明感染的心肌细胞有人β2-AR;在荧光显微镜下可观察到心肌细胞表达EGFP;放射性配基检测显示感染的心肌细胞β-AR密度[(204.0±6.4)fmol/mg蛋白]明显高于未感染的心肌细胞[(76.0±2.8)fmol/mg蛋白,P＜0.01];经10μmol/L异丙肾上腺素作用,感染的心肌细胞的cAMP含量[(116.2±5.8)pmol/106cells]明显高于对照组[(58.4±4.6)pmol/106cells,P＜0.01].结论人β2-AR、EGFP基因经AAV载体导入心肌细胞后能有效地表达,且表达的人β2-AR具有激活肾上腺素信号的作用.     

腺病毒载体介导的人β_2-肾上腺素能受体基因导入心肌细胞的研究

目的　观察重组缺陷型腺病毒即腺病毒载体介导的人 β2 肾上腺素能受体 (β2 AR)基因导入大鼠心肌细胞后 β2 AR的表达及其功能。方法　构建含人 β2 AR基因的腺病毒载体 (Adβ2 AR) ,转染大鼠的心肌细胞 ,检测心肌细胞对人 β2 AR的表达及环磷酸腺苷 (cAMP)的含量。结果　Northern印迹杂交显示Adβ2 AR转染的心肌细胞表达人 β2 -ARmRNA ;Western免疫印迹杂交分析表明转染的心肌细胞有人 β2 AR ;放射性配基检测显示转基因心肌细胞的 β AR密度 [(2 34± 6 .4)fmol/mg蛋白 ]是未转染的心肌细胞密度 [(76± 2 .8)fmol/mg蛋白 ]的 3倍 (P <0 .0 1 ) ;经 1 0 μmol/L异丙肾上腺素作用 ,转基因的心肌细胞的cAMP量 [(1 2 4± 6 .8)pmol/ 1 0 6 细胞 ]明显高于对照组 [(58.4± 4 .6)pmol/ 1 0 6 细胞 ] (P <0 .0 1 )。结论　人 β2 AR基因经腺病毒载体导入心肌细胞后能有效地表达并有激活肾上腺素信号的作用     

腺病毒载体介入的人β2—肾上腺素能受体基因导入心肌细胞的研究

目的：观察重组缺陷型腺病毒即腺病毒载体介导的人β2肾上腺素受体（β2－AR）基因导入大鼠心肌细胞后β2－AR的表达及其功能,方法：构建含人β2－AR基因的腺病毒载体（Adβ2－AR）,转梁大鼠的心肌细胞,检测心肌细胞对人β2－AR的表达及环磷酸腺苷（cAMP)的含量。结果：Northern印迹杂交显示Adβ2－AR转染的心肌表达人β2－ARmRNA;Western免疫印迹杂交分析表明转染的心肌细胞有人β2－AR;放射性配基检测显示转基因心肌细胞的β－AR密度[（234±6．4）fmol/mg蛋白]是未转染的心肌细胞密度[(76±2．8）fmol/mg蛋白]的3倍（P＜0．01）;经10μmol/L异丙肾上腺素作用,转基因的心肌细胞的cAMP量[（124±6．8）pmol/10^6细胞]明显高于对照组[（58．4±4．6）pmol/10^6细胞]（P＜0．01）。结论人β2－AR基因经腺病毒载体导入心肌细胞后能有效地表达并有激活肾上腺素信号的作用。     

β_2-肾上腺素受体亚型激动对于血管平滑肌细胞增殖的影响

目的研究β2-肾上腺素受体亚型(beta2-adrenergic receptor,β2-AR)激动对于血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的调控效应。方法应用携带重组β2-AR片段的腺病毒感染VSMC制备受体过表达模型。分别应用Zinterol(ZIN)以及异丙基肾上腺素(ISO)刺激生理状态和β2-AR过表达的平滑肌细胞后,采用四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法和细胞计数法检测吸光度(A,曾称光密度OD)值和细胞数目的改变。结果ZIN刺激1天时A值开始下降(P<0.05),3天时抑制作用达高峰,抑制率为(32.00±1.62)%。细胞计数法测得ZIN激动3天时细胞数为对照组的(69.29±9.26)%。应用CGP20712A阻断β1-AR激活后,非选择性-βAR激动剂ISO刺激细胞后得到结果相似。特异性β2-AR拮抗剂ICI 118,551可逆转此抑制效应。ISO刺激过表达的β2-AR 3天时MTT检测结果相似。结论β2-AR亚型激动可抑制VSMC的增殖。     

干预G蛋白βγ亚基介导的信号转导途径对心肌细胞肥大的影响

目的 研究G蛋白βγ亚基在心肌细胞肥大中的作用.方法 采用细菌内同源重组方法制备重组腺病毒载体rAd-βARKct 50 MOI(multiplicity of infection)感染经去甲肾上腺素处理肥大乳鼠心肌细胞,荧光倒置显微镜下观察心肌细胞形态及绿色荧光蛋白的表达,EMAIL图像分析软件测定心肌细胞的表面积,RT-PCR检测βARKct、α-MHC和β-MHC的mRNA表达水平.结果 经测序鉴定证实rAd-β ARKct构建成功,对心肌细胞的感染率40%～50%,与去甲肾上腺素组相比,重组腺病毒组α-MHC定量比值显著上升,β-MHC定量比值显著降低.结论 编码βARKct的重组腺病毒表达载体可以体外感染乳鼠心肌细胞并在心肌细胞中表达βARKct;抑制Gβγ蛋白的功能,可显著逆转去甲肾上腺素介导的肌球蛋白重链表型的改变(α-MHC/β-MHC),逆转心肌细胞肥大.     

GSK-3β特异siRNA腺病毒对脐静脉内皮细胞增殖的影响

目的 以糖原合成酶激酶3B(GSK-3β)特异的RNA干扰(RNAi)腺病毒表达载体作为研究工具,初步探讨Wnt/β-连环蛋白(Wnt/β-catenin)信号通路对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的影响.方法 利用体外同源重组技术构建GSK-3β特异的siRNA腺病毒表达载体,在HEK293A细胞中包装并扩增病毒、空斑实验法测定病毒滴度.GSK-3β特异的RNAi腺病毒感染HUVEC,Western印迹和免疫细胞化学法检测其对GSK-3β和β-catenin蛋白表达的影响,以四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖.结果 成功构建了GSK-3β特异的siRNA腺病毒表达载体,获得高滴度的腺病毒液.构建的重组腺病毒感染HUVEC显著抑制GSK-3β蛋白的表达,增加β-catenin的蛋白表达.重组腺病毒感染3、5、7 d后,细胞增殖率明显增加(P<0.05或P<0.01).结论 构建的GSK-3β特异的siRNA腺病毒能有效抑制GSK-3β基因的表达,促进β-catenin的蛋白表达,上调Wnt/β-catenin信号通路对人脐静脉内皮细胞增殖有重要的影响.     

人QKI6基因重组腺病毒载体的构建及其在心肌细胞中的表达鉴定

目的:构建人RNA结合蛋白（QKI6）基因的重组腺病毒载体,并在心肌细胞中表达。方法:利用PCR技术,从原始质粒中扩增出QKI6目的基因片段,酶切后连接到pShuttle-GFP-CMV重组穿梭质粒上。再将pShuttle-GFP-QKI6 转移到pAdxsi载体上,得到带有QKI6目的基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6。酶切、PCR鉴定重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6,并完成扩增与纯化。经Pacl线性化后,转染HEK 293细胞进行腺病毒包装,并测定病毒的滴度及目的基因的表达。以包装好的重组腺病毒感染大鼠新生心肌细胞,通过GFP表达观察病毒感染效率。用PCR检测目的基因QKI6在感染的心肌细胞中的表达。结果:含QKI6基因及GFP荧光指针的重组腺病毒载体pAdxsi-GFP-QKI6构建成功,酶切、PCR鉴定及DNA测序证实了其正确性。重组腺病毒可重复感染HEK 293细胞,荧光显微镜下可见GFP表达,且QKI6基因的表达明显升高。包装的重组腺病毒可有效感染新生心肌细胞,并表达目的基因QKI6。结论:成功地构建QKI6基因重组腺病毒载体,以其感染293细胞及新生心肌细胞后,可有效地表达QKI6基因,为进一步研究QKI6基因在糖尿病心肌细胞凋亡的机制以及在糖尿病性心肌病治疗中的应用奠定实验基础。     

Nrdp1 siRNA重组腺病毒载体的构建及其对心肌肥大的影响

目的构建及鉴定神经调节素受体蛋白1(Nrdp1)基因siRNA重组腺病毒载体,初步研究Nrdp1基因对心肌细胞肥大的影响。方法设计并合成Nrdp1的siRNA靶向DNA序列,克隆至穿梭载体GV119中,并与腺病毒骨架质粒Ad Max在BJ5183细菌中进行同源重组,转染HEK293细胞,包装得到含si Nrdp1的重组腺病毒,实时定量PCR及Western blot检测重组腺病毒对新生大鼠原代心肌细胞Nrdp1表达的影响。然后利用血管紧张素Ⅱ和沉默Nrdp1的腺病毒干预体外培养的新生大鼠原代心肌细胞,实时定量PCR检测心肌肥大标志基因(ANF、β-MHC、Skeletal-α-actin)的表达。结果酶切后PCR分析、测序鉴定表明,干扰Nrdp1腺病毒构建成功,病毒纯化后滴度为1.5E+9 PFU/m L;重组干扰Nrdp1腺病毒可在蛋白水平和mRNA水平明显抑制Nrdp1的表达(P0.001);沉默Nrdp1基因后,可明显上调血管紧张素Ⅱ诱导的心肌细胞肥大标志基因ANF、β-MHC和Skeletal-α-actin的表达(P0.01)。结论构建的Nrdp1 siRNA重组腺病毒能有效地抑制新生大鼠原代心肌细胞中Nrdp1表达,且Nrdp1基因沉默后可加重AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。     

重组腺病毒介导的人p27kipl基因高表达对体外培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞迁移的影响

目的探讨重组腺病毒介导的p27kip1基因及其蛋白产物高表达对血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移的抑制作用.方法将含人p27kip1cDNA的重组腺病毒(Adhp27kip1)及含β-半乳糖苷酶基因的重组腺病毒(AdLacZ)在体外转染原代大鼠主动脉VSMCs,用Western blot及Boyden趋化小室检测外源性p27kip1蛋白在细胞内的表达及对VSMCS迁移的影响.结果转染后24h,Adhp27kip1转染的VSMCs内p27kip1蛋白高表达,而AdLacZ转染的VSMCs内仅显示极低水平的内源性p27kip1蛋白表达;Boyden趋化小室检测显示未转染的VSMCs、AdLacZ及Adhp27kip1转染的VSMCs血清诱导后的迁移细胞数分别为139±26、106±16及68±14.结论外源性p27kip1基因及蛋白产物在VSMCs内高表达可显著抑制VSMCs的迁移.     

AKAP1过表达腺病毒载体构建及其在心肌细胞中的功能初步研究

目的 利用AdEasy腺病毒载体系统构建A激酶锚定蛋白（AKAP）1重组腺病毒载体,初步探索AKAP1在心肌细胞中的功能。 方法 以正常小鼠心肌细胞cDNA为模板,利用PCR获取AKAP1基因,构建腺病毒重组质粒pAdEasy-AKAP1。用293A细胞,包装重组腺病毒Ad-AKAP1颗粒,并用荧光蛋白标记法测定其滴度。用Western blot检测重组腺病毒感染原代小鼠心肌细胞和糖尿病心肌病细胞模型后AKAP1、Caspase-3的表达情况,用流式细胞仪检测原代小鼠心肌细胞内ROS生成水平及AKAP1对高糖状态下心肌细胞凋亡的影响。 结果 构建了携带AKAP1基因的过表达腺病毒载体,并获得5×1010 pfu/ml的高滴度重组腺病毒。重组腺病毒可感染原代心肌细胞和糖尿病心肌病模型H9c2细胞并介导AKAP1过表达（P<0.05）。与阴性对照组相比,过表达AKAP1可抑制高糖高脂状态下心肌细胞内ROS的生成（P<0.05）,可抑制高糖状态下心肌细胞的凋亡和Caspase-3活化（P<0.01）。 结论 过表达AKAP1对高糖高脂状态下的心肌细胞具有潜在保护作用,对心肌功能发挥具有重要作用。其机制可能与AKAP1抑制心肌细胞内ROS生成、抑制Caspase-3活化、抑制细胞凋亡有关。     

EB病毒潜伏期膜蛋白LMP2A对胃癌细胞增殖的影响

目的:构建EBV潜伏期膜蛋白基因LMP2A的腺病毒表达载体,探讨LMP2A表达对胃癌细胞的作用.方法:RT-PCR扩增获取目的基因LMP2A,采用AdEasy系统构建携带目的基因的重组腺病毒载体pAd-2A,脂质体法将重组质粒pAd-2A转染HEK293细胞包装重组腺病毒.用重组腺病毒感染靶细胞SGC(胃癌细胞),通过MTT实验、流式细胞分析、激光共聚焦检测目的基因LMP2A表达对靶细胞增殖的影响.结果:限制性酶切、PCR及测序鉴定证实,目的基因LMP2A正确插入重组质粒,HEK293细胞成功包装出具有稳定感染性的重组腺病毒,命名为vAd-2A,经测定病毒滴度为3.16×10~(12)pfu/L.MTT实验、流式细胞分析以及激光共聚焦检测结果显示,感染腺病毒vAd-2A的SGC细胞增殖旺盛(感染vAd-2A细胞vs感染vAd细胞和未感染病毒细胞,P<0.01),S期细胞比例升高(24 h:35.2%±5.1%vs 14.0%±3.4%,13.2%±4.6%,P<0.01;48 h:25.6%±4.1%vs 12.9%±2.6%,12.5%±3.2%,P<0.01),LMP2A可诱导细胞周期调节蛋白cyclinE的表达.结论:成功构建了EBV潜伏期膜蛋白基因LMP2A的重组腺病毒表达载体,并在HEK293细胞中成功包装出重组腺病毒,同时证实LMP2A可通过诱导cyclinE的表达促进SGC细胞增殖.     

重组腺病毒介导的人p27kip1基因高表达对体外培养的大鼠主动脉血管平滑肌细胞迁移的影响

目的　探讨重组腺病毒介导的p2 7kip1基因及其蛋白产物高表达对血管平滑肌细胞 (VSMCs)迁移的抑制作用。方法　将含人p2 7kip1cDNA的重组腺病毒 (Adhp2 7kip1)及含 β 半乳糖苷酶基因的重组腺病毒 (AdLacZ)在体外转染原代大鼠主动脉VSMCs,用Westernblot及Boyden趋化小室检测外源性p2 7kip1蛋白在细胞内的表达及对VSM Cs迁移的影响。结果　转染后 2 4h ,Adhp2 7kip1转染的VSMCs内p2 7kip1蛋白高表达 ,而AdLacZ转染的VSMCs内仅显示极低水平的内源性p2 7kip1蛋白表达 ;Boyden趋化小室检测显示未转染的VSMCs、AdLacZ及Adhp2 7kip1转染的VSMCs血清诱导后的迁移细胞数分别为 139± 2 6、10 6± 16及 6 8± 14。结论　外源性p2 7kip1基因及蛋白产物在VSMCs内高表达可显著抑制VSMCs的迁移     

非复制型腺病毒介导抗-HBc单链抗体的细胞内表达

目的探讨非复制型腺病毒介导抗-HBc单链抗体(ScFv)细胞内表达效率,并确定是否具有特异性抗原结合活性。方法将经细菌内同源重组并在293细胞中包装产生的携带抗HBc ScFv基因的非复制型重组腺病毒,按感染复数为10体外转染HepG2细胞,荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达；取培养上清液和细胞裂解上清液进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western blot法检测HBc ScFv表达。结果重组腺病毒Ad-ScFv感染HepG2细胞后,荧光显微镜下观察到HepG2细胞中绿色荧光蛋白；十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳显示培养上清液和细胞裂解物中可见2.7×10~4左右的蛋白条带；Western blot显示有乙型肝炎核心抗原特异性结合活性阳性反应条带出现。结论携带抗-HBc ScFv基因的非复制型重组腺病毒能在真核细胞中有效表达抗-HBc ScFv,并具有特异性抗原结合活性。     

慢病毒转染的β3-AR基因对心肌肥厚的影响

目的:探讨β3肾上腺素能受体(β3-AR)对SD大鼠乳鼠心肌肥大的影响及其机制。方法:体外培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,用携带β3-AR基因的慢病毒转染细胞后,用去甲肾上腺素(NE)诱导细胞48h,建立心肌细胞肥大模型。实验分4组:空白对照组(Control组)、心肌肥厚组(NE组)、β3-AR基因转染+NE组(β3-AR组)、空病毒转染+NE组(空病毒组)。用免疫荧光法鉴定心肌细胞,倒置荧光显微镜观察病毒转染组绿色荧光蛋白(GFP)表达,免疫印迹法(Western Blot)检测β3-AR、丝裂原活化蛋白激酶p38(p38MAPK)、细胞外信号调控激酶(ERK1/2)、磷酸化p38MAPK(p-p38MAPK)和ERK(p-ERK1/2)及原癌基因c-myc、c-fos蛋白水平的表达。结果:(1)慢病毒介导β3-AR基因转染心肌细胞,β3-AR表达较空白对照组明显升高。(2)用Western Blot检测各实验组细胞原癌基因c-myc、c-fos表达,其中NE组、β3-AR组、空病毒组表达均高于空白对照组,其中β3-AR组cmyc、c-fos表达明显高于NE组。(3)NE组、β3-AR组、空病毒组p38MAPK及ERK1/2的磷酸化水平较空白对照组明显上调,其中β3-AR组表达最高。结论:慢病毒介导的β3-AR基因转染使心肌细胞有效高表达β3-AR,β3-AR可能通过MAPK通路促进心肌肥厚。     

联合应用泛素分子基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7、GcS0.7重组腺病毒的构建及鉴定

目的 构建含有泛素(ubiquitin , Ub)基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0 . 7和GcS0 . 7重组腺病毒. 方法 通过PCR扩增获得Ub基因, 分别克隆入本室已构建的重组腺病毒转移载体pShuttle-pCAG-GnS0.7和pShuttle-pCAG-GcS0.7中,进一步通过双酶切将转移载体中的嵌合基因分别克隆入腺病毒载体, 得到重组腺病毒载体rAd-pCAG-Ub-GnS0.7和rAd-pCAG-Ub-GcS0.7,使用Pac Ⅰ线性化后转染HEK293细胞,包装后获得重组腺病毒,感染HEK293细胞后用免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay, IFA)检测表达产物. 结果 限制性内切酶酶切鉴定、PCR扩增和测序结果显示,各重组腺病毒转移载体及重组腺病毒载体构建正确. IFA检测到各重组腺病毒中目的蛋白的表达. 结论 成功制备了含有Ub基因的汉滩病毒嵌合基因GnS0.7和GcS0.7重组腺病毒, 为进一步研究联合Ub基因的汉滩病毒重组腺病毒的免疫学特性奠定了实验基础.     

大鼠ANT1基因腺病毒载体的构建及体外表达

目的 构建大鼠线粒体蛋白ANT1基因的腺病毒载体,并检测其在体外培养的血管平滑肌细胞(VSMCs)中的表达.方法 将大鼠线粒体膜蛋白腺(嘌呤核)苷酸移位酶(adenine nucleotide translocase,ANT)1基因片段克隆至穿梭质粒pShuttle-GFP-CMV上,在细菌中将穿梭质粒和pAdXsi载体进行重组,经脂质体转染HEK293细胞对重组腺病毒包装、扩增,用其感染体外培养的VSMC.采用PCR方法对重组体腺病毒进行鉴定,荧光显微镜观察转染效率.用Western印迹检测转染后ANT1在VSMC中的表达.结果 酶切鉴定及PCR结果表明ANT1基因重组腺病毒载体构建成功,病毒滴度达2×1011 pfu/ml,Western印迹检测ANT1在VSMC中表达明显高于对照组(P<0.05).结论 成功构建了含大鼠ANT1基因的重组腺病毒载体并在VSMCs有效表达,为以后将Ad-ANT1应用于VSMCs凋亡的研究奠定了基础.     

不同型别登革病毒融合外膜基因重组腺病毒的构建及表达

目的构建登革病毒1型和2型外膜蛋白(E蛋白)DⅢ区融合基因的重组腺病毒,在BHK-21细胞中表达。方法用PCR法扩增登革病毒1型和2型EDⅢ基因,依次克隆入pCDNA3.1(+),构建重组质粒pCDNA-D1/D2EDⅢ。以此为模板,扩增包含CMV启动子-D1/D2EDⅢ-BGHpA的表达片段,与pENTR4载体连接形成质粒pENTR4-D1/D2EDⅢ,与pAd/PL-DEST进行体外同源重组,形成重组腺病毒载体pAd-D1/D2EDⅢ,在293A细胞系中包装成具有感染性的重组腺病毒,进一步感染BHK-21细胞,用间接免疫荧光法和Westernblot法检测重组蛋白在细胞中的表达情况。结果重组腺病毒构建成功,转染293A细胞后获得2×109pfu/mL滴度的重组腺病毒,感染哺乳动物细胞后能够表达1型和2型EDⅢ区目的蛋白。结论不同型别融合基因的重组腺病毒表达载体能有效地表达相应型别的目的蛋白,为进一步构建单一的四价重组腺病毒应用于登革疫苗研究奠定基础。     

重组腺病毒载体携带多药耐药基因1反义RNA靶向逆转肝癌细胞多药耐药

目的 探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,mdr1)反义RNA的重组腺病毒载体靶向逆转甲胎蛋白阳性(AFP+)的肝癌多药耐药细胞HepG2R的疗效及作用机制.方法 分别构建携带AFP启动子和mdr1基因反义核苷酸片段的重组腺病毒载体Adeno-asmdr及携带AFP启动子和增强绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体Adeno-EGFP,将Adeno-EGFP转染人正常肝细胞L02(AFP-),人官颈癌细胞HeLa(AFP-)及HepG2(AFP+)细胞,检测增强绿色荧光蛋白基因在各细胞的转录水平;将Adeno-asmdr转染HepG2R细胞,Western blot检测不同时间P-gp170的表达,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法检测HepG2R细胞凋亡,流式细胞术检测HepG2R细胞在不同药物作用下细胞周期、凋亡率.结果 增强绿色荧光蛋白基因在AFP阳性的HepG2细胞可得到显著转录,而在L02细胞和HeLa细胞,其转录减少,显示了该载体的良好转录活性以及靶向特异性.Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后,HepG2R细胞P-gp170表达明显减弱,HepG2R细胞凋亡增加,HepG2R细胞对多种化疗药物的耐受能力明显下降,细胞出现显著的周期阻滞,大量细胞被阻滞于S期和G0/M期,凋亡细胞比例增加.结论 实验构建的Adneo-asmdr重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2R细胞内特异靶向性表达目的 基因,并可有效降低mdrl基因产物P-gp170的表达,从而达到对HepG2R细胞多药耐药的逆转作用.     

hVEGF165四环素调控腺病毒载体的构建及其在大鼠成肌细胞表达

目的构建表达人血管内皮生长因子165基因(hVEGF165)的四环素调控重组腺病毒,并测定其在原代培养大鼠成肌细胞的表达水平。方法亚克隆hVEGF165全长cDNA到穿梭质粒pTREShuttle2,获得四环素可调控的目的基因表达盒;亚克隆表达盒到BDAdeno-XTMViralDNA,获得重组腺病毒质粒;重组质粒转染HEK293细胞以包装产生具有感染能力的重组腺病毒颗粒AdTRE.VEGF165。hVEGF165重组腺病毒和Tetoff调节病毒共感染原代培养的成肌细胞,酶联免疫法检测目的基因的表达。结果成功构建了能表达hVEGF165的四环素调控的重组腺病毒载体。hVEGF165重组腺病毒(20pfu/cell)和Tetoff调控病毒(20pfu/cell)共感染骨骼肌成肌细胞后5d,ELISA检测显示培养上清中VEGF165蛋白浓度显著高于未感染的细胞培养上清[(14.80±1.15ng/ml)×105/(cell·24h)vs(1.39±0.36ng/ml)×105/(cell·24h),P<0.01)]。结论四环素调控表达的腺病毒系统可高效地转导VEGF基因进入哺乳动物细胞;原代培养的骨骼肌成肌细胞感染AdTRE.VEGF165后可高水平地分泌VEGF165蛋白。     

腺病毒siRNA抑制RhoA基因并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡的研究北大核心CSCD

目的建立RhoA基因的腺病毒siRNA系统,并联合TNF-α诱导肝癌细胞凋亡,分析RhoA在肿瘤细胞中的功能和作用。方法用已构建的RhoA干扰质粒构建RhoA的腺病毒siRNA系统,筛选重组病毒并感染HepG2细胞,应用Western blot和RT-PCR检测RhoA蛋白表达和基因表达水平。感染Ad-siRNA-RhoA腺病毒的肝癌细胞用TNF-α诱导后进行MTT以及细胞内DNA片段化检测。结果成功构建RhoA基因的siRNA腺病毒系统。用重组病毒感染肝癌细胞,RhoA蛋白表达抑制率为76.48%;RhoA基因的mRNA转录水平降低74.46%。MTT检测显示,感染腺病毒Ad-U6-control对照组以及感染腺病毒Ad-siRNA-RhoA实验组的细胞A值差异无统计学意义(F=5.41,P>0.01),即利用siRNA抑制肝癌细胞中RhoA表达,肿瘤细胞凋亡不明显。TUNEL检测显示,RhoA腺病毒siRNA联合TNF-α致肿瘤细胞凋亡作用显著。结论构建的腺病毒siRNA载体系统能抑制目的基因RhoA的表达,联合TNF-α能抑制肿瘤细胞生长和增殖并诱导肿瘤细胞凋亡,为肿瘤基因功能的基础研究和肿瘤基因治疗打下了实验基础。