应用胶体金探针技术IGSS进行猪囊尾蚴与抗猪囊尾蚴囊液抗原McAb特异性结合的定位研究

本文报道将IGSS应用于抗猪囊尾蚴囊液抗原的McAb与猪囊尾蚴特异性结合的定位研究。用猪囊尾蚴囊液抗原免疫BALB/C小鼠的脾细胞与胃髓瘤细胞系NS-D融合,经克隆化获得三株分泌抗猪囊尾蚴囊液抗原的McAb杂交瘤细胞A_(91)、G_(11)、F_(3),用ELISA检测证实杂交瘤细胞分泌特异性抗体。对其诱生腹水经ELISA、IHA检测显示腹水中高效价特异性的McAb,     

抗隐孢子虫单克隆抗体研制及其特异性的鉴定

目的：制备抗隐孢子虫单克隆抗体（McAb）并对其特异性进行鉴定。方法：用纯化的人源微小隐孢子虫卵囊免疫BALB／c小鼠，杂交瘤技术制备McAb，间接免疫荧光（IFA）和免疫印迹试验分析其特性。结果：制备出Z4C8、Z2B6、Z3D7和Z3D2四株能稳定分泌抗隐孢子虫McAb的杂交瘤细胞株。经鉴定，Z4C8和Z3D7为IgM ，Z3D2和Z2B6为IgG1，轻链均为κ链，与多种肠道病原体及肺孢子虫无交叉反应。除Z2B6在间接免疫荧光试验中识别卵囊壁外，其余均识别隐孢子虫子孢子（CSP）。免疫印迹定位表明，四株McAb分别识别42条CSP抗原中的20．5kDa、60．5kDa、33kDa和95kDa4个条带，其中Z4C8和Z3D7均识别20．5kDa主要抗原带。结论：这四株McAb在识别CSP抗原表位上具有不同的特性，但对隐孢子虫抗原均呈高度特异性反应。     

抗旋毛虫肌幼虫ES抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备分泌抗旋毛虫肌幼虫排泄分泌(ES)抗原单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞株,并对其及分泌的McAb进行鉴定。方法用旋毛虫肌幼虫ES抗原免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选分泌特异性、高滴度McAb的杂交瘤细胞株,制备腹水,进行纯化。ELISA间接法、夹心法和竞争法分别测定McAb滴度、相对亲和力和相加效应,琼脂双扩散试验鉴定免疫球蛋白类型,检测McAb与其他寄生虫抗原的交叉反应。电镜观察杂交瘤细胞超微结构,计数染色体数目及观察杂交瘤细胞分泌McAb的稳定性。结果筛选出2株(B2C12和E11F11)分泌抗旋毛虫肌幼虫ES抗原McAb杂交瘤细胞株。电镜显示,杂交瘤细胞具有肿瘤细胞和浆细胞的特征,胞浆内可见大量分泌颗粒;杂交瘤细胞染色体数目平均为98.6条,均能稳定分泌McAb(属IgM)。B2C12株培养上清液和腹水McAb滴度分别为1∶1280和1∶2.048×104,E11F11株为1∶640和1∶1.024×104,其中前者的相对亲和力较后者稍高。2株McAb识别ES抗原不同的抗原决定簇;且不与其他寄生虫抗原发生交叉反应。结论获得2株抗旋毛虫肌幼虫ES抗原杂交瘤细胞株,均能稳定分泌高滴度、特异性的IgM类McAb,并识别不同的抗原决定簇,为研制旋毛虫病诊断试剂盒和制备基因工程抗体奠定了基础。     

抗华支睾吸虫代谢抗原单克隆抗体的制备及鉴定研究

目的建立分泌抗华支睾吸虫代谢抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株。方法用华支睾吸虫成虫代谢抗原免疫BALB/c小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2／0融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫全虫可溶性抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应。结果获得3株分泌高滴度抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应，3株单抗均属IgG。结论制备的抗华支睾吸虫代谢抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗，为制备免疫诊断试剂盒奠定了基础。     

抗华支睾吸虫单克隆抗体的制备和鉴定

目的：建立分泌抗华支睾吸虫成虫的单克隆抗体杂交瘤细胞株并进行鉴定。方法：用华支睾吸虫成虫可溶性抗原免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，取其脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞ＳＰ２／０融合，筛选分泌高滴度单克隆抗体的杂交瘤细胞株，测定单抗免疫球蛋白亚类和单抗效价，检测单抗与日本血吸虫虫卵抗原、卫氏并殖吸虫成虫抗原和猪囊尾蚴抗原的交叉反应，用ＩＦＡＴ进行单抗识别的抗原定位。结果：获得５株分泌高滴度抗华支睾吸虫成虫单抗的杂交瘤细胞株，其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫和猪囊尾蚴抗原均不发生交叉反应；５株单抗均属ＩｇＭ；单抗所识别的抗原定位于华支睾吸虫肠管壁。结论：制备的抗华支睾吸虫成虫的杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗。     

乙型肝炎病毒核糖核酸酶H(HBV-RNaseH)蛋白单克隆抗体杂交瘤细胞株的建立及初步鉴定

目的建立能稳定分泌抗乙型肝炎病毒核糖核酸酶H1及H2(HBVRNaseH1及H2)重组蛋白单克隆抗体(McAb),并对其生物学活性进行实验室鉴定。方法用重组HBVRNaseH1及H2蛋白为抗原免疫BALB/c/小鼠,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0进行融合,经有限稀释克隆3次后制备分泌McAb的杂交瘤细胞株,并用酶免疫(EIA)法对其分泌抗体进行初步鉴定。结果融合后的阳性克隆中筛选出4株能稳定分泌McAb的杂交瘤细胞株,命名为H1C6、D3;H2E2、F4。这4株McAb与HBVRNaseH1及H2重组抗原均有良好的反应性,杂交瘤培养上清的EIA抗体滴度为1∶100～1∶200,其中2株诱生的同系小鼠腹水滴度为1∶800,1∶1000。这4株McAb均为IgG1亚型。结论该McAb的制备,可为HBV感染者血清和肝组织中抗原检测方法的建立和生物工程药物的研制创造条件。     

重组阴道毛滴虫黏附蛋白33单克隆抗体的制备及鉴定

目的制备重组阴道毛滴虫(T.υ)黏附蛋白33(AP33)单克隆抗体(McAb)并进行初步鉴定。方法将pET32(a)-AP33重组质粒转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),用0.5 mmol/L IPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA法纯化,以纯化的融合蛋白33为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,免疫印迹分析其特异性。结果共筛选出能稳定分泌抗AP33单克隆抗体的5株(4A2,4F11,4F8,4E7,4H11)杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1;腹水的上清效价为1∶40 000-1∶80 000。免疫印迹分析显示,5株单抗均能与重组阴道毛滴虫AP33发生特异性结合;与阴道毛滴虫抗原分子量为33kDa抗原分子结合。结论制备的抗重组AP33杂交瘤细胞株能分泌识别重组AP33的高特异性单抗,为进一步研究其在阴道毛滴虫病免疫诊断中的应用奠定了基础。     

并殖吸虫McAb识别靶抗原的IFAT固相抗原定位研究

本文报告应用16 种单克隆抗体(McAb)以间接荧光抗体试验(IFAT),对卫氏并殖吸虫(P.w)、斯氏狸殖吸虫(P.s)及三平正并殖吸虫(E.c)成虫及其子宫部位虫卵的冰冻切片作靶抗原的定位研究证明:以P.w成虫抗原制备的杂交瘤分泌的8种McAb中,4种具有高度特异性,只识别P.w的有关抗原,另4种与P.s或E.C出现交叉反应;以P.w囊蚴抗原所制备的杂瘤分泌的8种McAb中,2种具有高度特异性,只识别P.w的有关抗原,1种只识别E.c抗原,1种与E.c出现交叉反应,另4种不识别固相抗原片上的抗原.这些McAb识别抗原的部位主要为肠上皮、皮层、食管、排泄囊及卵壳.识别P.w 抗原显示的荧光均较P.s、E.c者为强.     

三株分泌抗细粒棘球蚴囊液抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞的建立和初步鉴定

以羊肝细粒棘球蚴囊液抗原免疫BaLb/c鼠脾细胞与SP2/o骨髓瘤细胞常规方法融合。用人肝棘球蚴囊液抗原间接ELISA法检测,获得3株稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,2G_4、2F_1和2F_(10)。对人肝包囊液抗原ELISA的终点分别为1∶204800,1∶819200和1∶3200。对纯化羊肝包囊液抗原致敏羊血球IHA的终点均为1∶512,但3株单抗等量混合后IHA滴度达1∶4096。对猪囊尾蚴抗原的ELISA滴度分别为1∶4000、1∶2000和1∶2000。对泡球蚴抗原ELISA滴度分别为1∶2000、1∶1000和1∶2000。交叉阻断ELISA试验的结果初步显示此3株单抗可能识别不同的抗原表位。3株细胞在液氮中冻存两年复苏后,仍继续稳定分泌抗体。     

免疫金银法标记抗猪囊尾蚴囊液抗原McAb与猪囊尾蚴特异性结合的定位研究

McAb F_3在猪囊尾蚴上的结合部位经免疫金银法标记定位,冰冻及石腊切片均显示出清晰的结合位点。囊壁部位颗粒均匀呈双层分布,头节折叠部位皱襞的凹陷处黑色颗粒呈密集的小片状。免疫金银法所标记的抗猪囊尾蚴囊液与其相应抗原的结合部位与囊尾蚴细胞层的分布相一致。     

恶性疟原虫乳酸脱氢酶单克隆抗体的制备及其鉴定

[目的 ]制备抗恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)单克隆抗体 (McAb) ,并对其特异性进行鉴定。[方法 ]用纯化的LDHp重组抗原免疫BALB/c小鼠 ,采用杂交瘤技术制备McAb ,筛选分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株 ,测定其免疫球蛋白亚类及其效价 ,ELISA、Westernblot试验分析其特异性。 [结果 ]筛选出 2A5和1H10两株能稳定分泌抗LDHpMcAb的杂交瘤细胞株 ,两株单抗均为IgG2b,2A5和 1H10培养上清的ELISA效价分别为 1∶5 12和 1∶2 5 6 ,腹水效价分别为 1∶2 5 6 0 0和 1∶12 80 0 ,两株单抗与间日疟原虫、红细胞、弓形虫、日本血吸虫等抗原均不发生交叉反应 ,能识别恶性疟原虫 33kDa的虫源蛋白。 [结论 ]制备的抗LDHp杂交瘤细胞株能分泌高滴度和高特异性的单抗     

抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体的研制及初步应用

目的制备抗广州管圆线虫成虫单克隆抗体并研究其初步应用。方法用广州管圆线虫成虫可溶性抗原免疫BALB/c小鼠,经融合,筛选分泌高滴度、高特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。使用所得的单克隆抗体以Western blotting检测广州管圆线虫病患者血清,并建立双抗体夹心ELISA法检测感染大鼠血清。结果获得3株分泌高滴度抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株(2A2、3F1、4H2),其分泌的抗体与日本血吸虫、卫氏并殖吸虫、猪囊尾蚴、旋毛虫抗原均不发生交叉反应。3株单克隆抗体均可识别广州管圆线虫成虫可溶性抗原蛋白Mr 15 000,以及患者血清中两种循环抗原Mr24 000和Mr15 000。双抗体夹心ELISA检测阳性率为76.5%。结论制备的抗广州管圆线虫成虫可溶性抗原的杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的单克隆抗体,且在循环抗原的检测方面有应用前景。     

抗猪囊尾蚴单抗、双特异单抗建株及检测血清循环抗原的研究

目的：检测猪囊尾蚴病人的血清循环抗原。方法：制备两株分泌抗猪囊尾蚴单克隆抗体杂交瘤细胞系和两株分泌抗猪囊尾蚴和抗绵羊红细胞双特异单克隆抗体杂交瘤细胞系，分别命名为Ⅱ０３、Ⅰ０６Ｄ５、Ⅱ０３Ｇ２和Ⅱ０３Ｆ４。应用Ⅱ０３细胞株分泌的单抗和Ⅱ０３Ｇ２分泌的双特异单抗，用反向ＩＨＡ法检测血请循环抗原。结果：检测猪囊尾蚴病治疗前病人１２０例，经吡喹酮治疗４个疗程病人３２例、经吡喹酮治疗７个疗程的病人２３例和绦虫病人１５例，单抗检测血清循环抗原阳性率分别为９０％、３７．５％、１７．４％、４０％；双特异单抗检测血清循环抗原阳性率分别为９１．７％、３７．５％、１３％、４６．７％。检测４１例其他寄生虫感染者和５０例健康人血清，未出现任何交叉反应。两种单抗检测结果亦无显著差异（Ｘ２＝０．０１３９，Ｐ＞０．０５）。结论：Ⅱ０３单抗和Ⅱ０３Ｇ２双特异单抗检测血清循环抗原具有较高的特异性和敏感性，并对疗效考核有一定参考价值。     

亚洲带绦虫45 kDa雌激素调节蛋白的表达及其杂交瘤细胞株的筛选与鉴定

目的筛选并制备亚洲带绦虫45 kDa雌激素调节蛋白(Ta EP45)的杂交瘤细胞株。方法设计带有酶切位点的特异性引物,以亚洲带绦虫成虫总RNA为模板, RT-PCR扩增Ta EP45完整的开放阅读框(ORF),克隆至原核表达载体pET-30a (+),转化至大肠埃希菌BL21 (DE3),用1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达带组氨酸(His)标签的TaEP4蛋白,用亚洲带绦虫囊尾蚴阳性猪血清蛋白质印迹(Western blotting)分析Ta EP45的反应原性。以纯化的Ta EP45免疫BALB/c小鼠(100μg/鼠,首次免疫用等量弗氏完全佐剂,第2、第3次免疫用等量弗氏不完全佐剂),选择血清抗体效价高的小鼠,取脾细胞和SP2/0骨髓瘤细胞融合,用纯化的Ta EP45和His标签蛋白ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,用亚洲带绦虫全虫抗原Western blotting鉴定杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。结果 RT-PCR扩增获得的Ta EP45基因ORF长1 362 bp,编码453个氨基酸。重组融合蛋白的相对分子质量(Mr)约为60 000,可被亚洲带绦虫囊尾蚴阳性猪血清识别。筛选获得5株稳定分泌Ta EP45抗体的杂交瘤细胞株,其抗体效价均≥1∶2 430,亚型分别为IgG2b或IgG1。Western blotting分析结果显示, 5株杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体均能与亚洲带绦虫全虫抗原发生反应。结论表达纯化了Ta EP45,筛选出5株能稳定分泌高滴度Ta EP45单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体能与亚洲带绦虫全虫抗原发生反应。     

几种猪囊尾蚴抗原用于EITB法诊断囊尾蚴病的观察

本研究对囊液10000g和100000g离心后的上清、头节抗原、全囊抗原及头节尿素溶解性抗原等5种抗原进行SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳。考马斯亮蓝染色依次出现10、10、13、14和5条显色带，银染结果依次出现20、20、21、21和13条显色带。分子量范围为＜6.6kDa－＞116kDa。选择囊液100000g（以下简称囊液）、全囊和头节尿素等3种抗原对105份各类血清进行酶联免疫电转移印斑（EITB）检测。结果囊尾蚴病患者血清与3种抗原反应可出现1－13条反应带，分子量范围6.6kDa－＞116kDa。如以≤21.5kDa条带作为判断标准，则囊液抗原、全囊抗原和头节尿素抗原的阳性率依次为54％、48％及58％，假阳性率依次为6％、10％及0％。头节尿素抗原对血吸虫、华支睾吸虫和肺吸虫病患者血清未出现交叉反应，10例包虫病患者血清中有2例出现交叉反应。     

抗猪隐孢子虫单克隆抗体的制备及鉴定

目的筛选特异性强、亲和力高的抗猪隐孢子虫(Cryptosporidiumsuis)单克隆抗体(McAb),并探讨其生物学活性。方法将纯化的猪隐孢子虫卵囊冻融和超声波处理后免疫BALB/c小鼠,取阳性免疫鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合;经间接ELISA法筛选,有限稀释法进行克隆;用间接ELISA叠加试验、间接免疫荧光试验鉴定McAbs的免疫反应活性。结果获得3株能稳定分泌抗猪隐孢子虫McAbs的杂交瘤细胞株,命名为1E1C5、1E11A5、2B7A1,分别属于Ig M、IgG3和IgG2a类;其细胞培养上清效价分别为1∶3200、1∶1600和1∶3200,小鼠腹水效价分别为1∶1.6×105、1∶1.6×105和1∶0.8×105;ELISA叠加试验表明3株单抗可识别两个不同抗原位点,1E1C5有较高的亲和力;免疫荧光试验结果显示3株单抗均能与猪隐孢子虫卵囊壁反应,但与艾美耳球虫、人隐孢子虫(C.hominis)有微弱的交叉反应。结论获得了3株可识别猪隐孢子虫卵囊壁的McAbs,为进一步开展猪隐孢子虫快速诊断研究奠定了基础。     

抗旋毛虫副肌球蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

目的利用杂交瘤技术制备分泌抗重组旋毛虫副肌球蛋白N端抗原（rTsP3）的单克隆抗体（McAb）并进行鉴定。方法以rTsP3免疫BALB/c小鼠,取其脾细胞与小鼠骨髓瘤SP2/0细胞融合,筛选分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,制备腹水并进行纯化,采用间接ELISA法测定培养细胞上清液及腹水中的McAb滴度、相对亲和力及抗体亚类,Western blot法鉴定抗体对抗原识别的特异性。结果获得了2株稳定分泌抗旋毛虫rTsP3的McAb杂交瘤细胞株,分泌的McAb分别为IgG2b亚类κ型和IgG1亚类κ型,亲和力常数分别为8.98×108mol/L和9.7×10^8mol/L,Western blot显示2株单抗均能识别旋毛虫成虫匀浆蛋白、rTsP3及重组副肌球蛋白（rTsPmy）。结论成功制备了抗旋毛虫rTsP3单克隆抗体,该单抗能识别旋毛虫副肌球蛋白抗原。     

抗弓形虫单克隆抗体的制备鉴定及应用

目的制备抗弓形虫全抗原、天然P30、重组P30的单克隆抗体（McAb），为抗原提纯、弓形虫病诊断及亚单位疫苗的研制奠定基础。方法用弓形虫全抗原、天然P30、重组P30分别免疫BALB／c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，筛选稳定分泌高滴度McAb的杂交瘤细胞株。用ELISA法测定McAb亚类和效价；通过SDS—PAGE和Western blot进行特异性鉴定;Giemsa染色观察杂交瘤细胞的染色体数目；利用电镜及IFAT观察McAb对弓形虫的杀伤作用及其作用位点。结果筛选出3株（4810、283、1H6）特异性较好的杂交瘤细胞株。Western blot结果显示，283、1H6产生的MeAb与弓形虫全抗原的阳性反应带均在30kDa处，4810反应带主要在22kDa处；283，1H6，4810MeAb的效价（ELISA）分别为：1：102400、1：51200、1：12800；283、1H6为IgM，4810为IgG2b；3株细胞的染色体数均在100条以上。电镜观察到McAb作用后的弓形虫虫体聚集、肿胀，表面出现缺口和空洞，虫体变形破碎、膜变厚。抗弓形虫全抗原及天然P30的McAb能准确识别重组体pET-30a—ROP2、pET-30a-P30的表达蛋白。结论抗弓形虫全抗原、P30抗原的McAb均对弓形虫具有明显的杀伤作用，能准确识别P30抗原，可应用于弓形虫病诊断、抗原鉴定及亚单位疫苗的研制。     

抗弓形虫重组SAG1抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的制备抗弓形虫SAG1单克隆抗体（McAb）. 方法将pET32（a）-trSAG1重组质粒转化Escherichia coli BL21（DE3）,用0.1 mmol/L IPTG诱导表达,超声破菌后获得可溶性表达产物,通过Ni-NTA一步法纯化,以纯化的rSAG1为抗原,免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备McAb,用ELISA和有限稀释法筛选出分泌高滴度McAb杂交瘤细胞株,测定其免疫球蛋白亚类及其效价,Western blot分析其特异性. 结果筛选出能稳定分泌抗rSAG1单克隆抗体的5株杂交瘤细胞株,抗体重链均为IgG1, 轻链均为κ链;Western blot 分析显示,5株单抗均能与弓形虫速殖子超声抗原中的天然SAG1发生特异性结合. 结论制备的抗rSAG1杂交瘤细胞株能分泌识别SAG1的高特异性单抗,为进一步研究其在弓形虫病免疫诊断中的应用奠定了基础.     

抗重组日本血吸虫P38抗原单克隆抗体的制备与鉴定

目的?摇在大肠埃希菌中可溶性表达日本血吸虫P38（SjP38）抗原分子，并以其纯化产物为抗原，制备抗SjP38单克隆抗体(McAb)。 方法 将pET32(a)-P38重组质粒转化大肠埃希菌BL21(DE3)，在1 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导下表达，超声破菌后获得可溶性表达产物，通过镍柱一步法纯化，以纯化的重组SjP38为抗原，免疫BALB/ｃ小鼠，采用杂交瘤技术制备McAb，用ELISA和有限稀释法筛选出高分泌滴度McAb杂交瘤细胞株，测定其免疫球蛋白亚类及其效价，蛋白质印迹法（Western blotting）分析其特异性。 结果 筛选出能稳定分泌抗重组SjP38单克隆抗体的8株杂交瘤细胞株，均为IgG1； Western blotting 分析显示8株单抗能与日本血吸虫虫卵抗原中的天然P38发生特异性结合。 结论 制备的抗P38杂交瘤细胞株能分泌高滴度、高特异性的McAb。