丙型肝炎病毒NS3基因酵母表达载体构建及表达

目的　为探讨丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS3的功能 ,在真核生物酵母细胞中表达HCVNS3基因。方法　用聚合酶链反应 (PCR)的方法以HCV全长质粒pBRTM/HCV 1为模板扩增HCVNS3基因 ,克隆到 pGEM T载体中 ,双酶切后回收连接到酵母表达质粒 pGBKT7中表达。提取酵母蛋白质 ,进行十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)和Western免疫印迹分析。结果　成功构建HCVNS3基因酵母表达载体 ,Western免疫印迹显示了HCVNS3在酵母细胞中表达。表达产物在胞内存在 ,相对分子质量为 70 0 0 0。结论　HCVNS3蛋白在酵母中表达成功。     

丙型肝炎病毒非结构蛋白4A与钙离子信号调节亲环素配体的相互作用

目的 应用酵母双杂交技术及免疫共沉淀技术证实HCV非结构蛋白4A（HCV NS4A）与钙离子信号调节亲环素配体（CAML）的相互作用。方法 对CAML编码基因进行克隆，并构建其酵母表达载体，在酵母细胞中与HCV NS4A进行回交验证后，构建HCV NS4A及CAML真核表达载体，转染293细胞，行免疫共沉淀实验及Western印迹检测。结果 成功克隆CAML基因，并构建CAML的酵母表达载体，在酵母细胞中回交验证HCV NS4A与CAML的相互作用，构建HCV NS4A及CAML的真核细胞表达载体，并利用免疫共沉淀技术验证了两者的相互作用。结论 CAML与HCV NS4A的相互作用可能对HCV感染细胞的钙离子浓度、细胞凋亡等生物过程产生影响，从而在HCV感染慢性化过程中发挥作用。     

乙型肝炎病毒前S2基因酵母表达载体的构建及表达

目的：探讨乙型肝炎病毒（HBV）前S2蛋白的功能。方法：以质粒pCP10 (含有HBV ayw亚型全长序列)为模板，多聚酶链反应（PCR）扩增HBV前S2基因，克隆到pGEM-T载休整 ，测序鉴定、酶切后回收，与酵母表达质粒pGBKT7连接。将重组载体转化酵母细胞AH109，提取酵母蛋白质，进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和Western免疫印迹分析。结果：成功构建HBV前S2基因酵母表达载体，Western免疫印迹显示HBV前S2蛋白在酵母细胞中表达，表达产物在胞内存在，分子量24kD左右。结论：HBV前S2蛋白在酵母细胞中表达成功。     

乙型肝炎病毒核心抗原诱饵载体的构建及酵母表达

目的 构建乙型肝炎病毒核心抗原真核表达载体,并在酵母细胞中进行表达. 方法 以实验室保存质粒为模板,通过聚合酶链式反应(PCR)扩增HBcAg基因,克隆到pGEM-T载体.测序正确后酶切并连接至酵母表达载体pGBKT7中,转化酵母菌AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp/Kana)上筛选阳性菌落后大量表达并提取重组蛋白,再进行SDS-PAGE和Western blot分析.结果 成功构建酵母表达载体pGBKT7-HBcAg,Western blot结果显示重组蛋白在酵母细胞中正确表达.结论 利用真核表达载体在酵母细胞中成功表达HBcAg蛋白,为研究HBV合并代谢性疾病的机制奠定了基础.     

乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活基因5在酵母细胞中的表达

目的：在真核生物酵母细胞中表达乙型肝炎病毒前S1蛋白反式激活基因5（PS1TP5）。方法：以HepG2细胞来源的mRNA为模板，经RT-PCR法扩增PS1TP5基因，克隆到pGEM-T载体中，并测序鉴定，酶切回收后连接到酵母表达质粒pGBKT7中，并转化酵母AH109，色氨酸缺陷型培养基（SD／-Trp）上筛选阳性菌落，提取酵母蛋白质，进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS—PAGE）和Western免疫印迹分析，以明确PS1TP5是否可在其中表达。结果：成功扩增出PS1TP5，测序鉴定符合基因库报告序列，酶切回收的PS1TP5基因片段成功克隆人酵母表达载体pGBKT7，并转化人酵母细胞AH109中，Western免疫印迹显示该基因在酵母细胞中成功表达，表达产物相对分子质量为36950。结论：成功构建了PS1TP5酵母表达载体，并在酵母细胞中表达。     

APP基因真核表达载体的构建及其在SH-SY5Y细胞中的稳定表达

目的 构建淀粉样前体蛋白(APP)基因真核表达载体,转染SH-SY5Y细胞,建立稳定转染细胞系.方法 从质粒pcDNAs-APP中经PCR扩增出APP基因,利用DNA重组技术将其插入到真核表达载体pcDNA3.1(+)中,经酶切和测序鉴定后,脂质体转染法转染SH-SY5Y细胞,通过G418选择培养,建立稳定转染细胞系,通过印迹法(Western blot)检测APP的表达. 结果 pcDNA3.1(+)-APP重组体经PCR扩增后片段大小约为2 300 bp,与预期相同.测序结果与目的序列相同,重组体载体构建成功.Western印迹检测到SH-SY5Y细胞中APP的表达. 结论 成功构建pcDNA3.1(+)-APP真核表达载体并稳定转染SH-SY5Y细胞,成功表达了目的基因,为进一步研究阿尔茨海默病分子学机制奠定了基础.     

HCV核心基因转染HepG2细胞后基因表达差异筛选

目的将真核表达载体pcDNA3.1(-)HCV core转染到HepG2细胞,在HepG2细胞中表达HCV核心蛋白,并筛选其中的差异表达基因。方法将构建的真核表达载体pCDNA3.1(-)HCVcore转染HepG2细胞后进行蛋白免疫印迹检测;将pcDNA3.1(-)HCVcore和pcDNA3.1(-)载体分别转染HepG2细胞后,提取mRNA并逆转录为cDNA,运用基因表达谱芯片技术分析差异表达基因。结果构建的真核表达载体经双酶切鉴定;转染HepG2细胞后HCV核心蛋白表达经蛋白免疫印迹证实;经基因表达谱芯片分析发现,其中基因表达水平显著上调和下调的分别是181个和48个。结论筛选HCV核心基因转染HepG2细胞后的糖类和脂类物质代谢相关的差异表达基因,从而为丙型肝炎病毒合并糖尿病、脂肪肝等代谢性疾病的分子生物学机制的研究提供了重要依据。     

隐源性肝炎相关新基因CHBP2的原核表达及蛋白纯化

目的:构建隐源性肝炎相关新基因CHBP2原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达,并纯化CHBP2融合蛋白。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR),以提取的Huh7细胞mRNA为模板,扩增获得CHBP2基因片段,连接到pGEM-T载体,测序正确后插入至原核表达载体pET-32a( )中,构建原核表达载体pET-32a( )-CHBP2,转化大肠杆菌BL21,以异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导,获得CHBP2融合蛋白的可诱导性表达,通过SDS-PAGE电泳、Western blot免疫印迹分析证实蛋白表达的特异性,超声破碎表达细菌,SDS-PAGE分析,利用镍离子亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。结果:成功构建原核表达载体pET-32a( )- CHBP2,并将CHBP2融合蛋白成功表达,通过Western blot免疫印迹,证实了蛋白表达的特异性。SDS-PAGE分析表明其为包涵体表达,并对蛋白成功进行了纯化和复性,获得了表达蛋白的纯品结论:成功表达、纯化CHBP2蛋白,为研究CHBP2蛋白的生物学功能打下了基础,     

弓形虫SAG2基因在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究

目的 在毕赤酵母（Pichia pastoris）表达系统中表达弓形虫SAG2基因,探索一种新的有效活化机体抗弓形虫免疫反应的疫苗。方法 以重组质粒pET23a-SAG2为模板,亚克隆目的片段SAG2至酵母菌分泌表达载体pPICZαA,重组质粒经线性化后电转化转染至毕赤酵母菌GS115菌株,经抗生素Zeocin筛选得到高拷贝转化子。经甲醇诱导表达,取细胞裂解上清进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹法（Western blot）分析。以整体重组酵母菌作为疫苗腹腔免疫BALB/c小鼠,检测小鼠的免疫反应。结果 成功构建了pPICZαA-SAG2毕赤酵母表达重组质粒。经甲醇诱导,在酵母细胞内表达分子质量单位为22 ku的蛋白。Western blot显示,22 ku蛋白可被抗-His标签抗体识别。结论 在毕赤酵母菌中成功表达了SAG2基因。整体重组酵母活菌具有免疫原性。     

三叶因子2相互作用蛋白基因在胃癌细胞cDNA文库中的筛选

目的:筛选并克隆人胃癌细胞eDNA文库中与三叶因子2(trefoil factor family 2,TFF2)蛋白相互作用的蛋白基因.方法:RT-PCR方法验证胃癌细胞存在TFF2mRNA表达:PCR法扩增TFF2基因,Not I与Sal I双酶切后定向克隆到酵母表达载体pDEST32,构建TFF2的诱饵质粒;Western blot验证TFF2诱饵质粒在酵母细胞中相应融合蛋白的表达:将诱饵质粒和人胃癌-cDNA文库猎物质粒共同转化MaV203酵母感受态细胞,通过营养缺陷型培养基(ura、His)与x-gal进行3重筛选阳性克隆,提取阳性克隆质粒测序,应用蛋白质数据库及生物信息学技术,对测序结果进行分析.结果:RT-PCR法证实胃癌细胞中存在TFF2mRNA表达;构建pDEST32-TFF2诱饵表达质粒成功:Western blot法证实诱饵质粒转化酵母细胞后正确表达TFF2-GAL4DBD融合蛋白:通过酵母双杂交筛选胃癌细胞cDNA文库,共获得35个表达His、Ura及x-gal报告基因的阳性克隆,其中测序成功为16个克隆,包含12个已知蛋白基因与4个未知功能基因.结论:从胃癌细胞cDNA文库中筛选出多种TFF2相互作用蛋白基因,其可能与胃癌的发生发展密切相关.     

乙型肝炎病毒e抗原真核表达载体的构建及在酵母中的表达

为探讨乙型肝炎病毒(HBV)e抗原(HBeAg)的功能，用多聚酶链反应(PCR)的方法以HBV ayw亚型全序质粒pCP10为模板扩增HBeAg基因，克隆到pGEM—T载体中扩增并测序，鉴定符合GenBank报告序列。用EcoRI和Pstl双酶切后回收片段，连接到真核表达载体pGBK17中并转化酵母AH109，在色氨酸缺陷型培养基(SD／—Trp)上筛选阳性菌落。提取阳性酵母菌的蛋白质，进行十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—PAGE)和Western免疫印迹分析，显示HBeAg基因在酵母细胞中表达，表达产物在胞内存在，相对分子质量(MT)为43000左右。     

酵母双杂交筛选肝细胞中乙型肝炎病毒表面抗原中蛋白结合蛋白基因

目的筛选并克隆人肝细胞中与HBsAg中蛋白(MHBs)相互作用肝细胞蛋白的基因,探讨MHBs的生物学功能。方法应用PCR法以HBV adr亚型全序质粒A7为模板扩增MHBs基因,克隆到pGEM-T载体中扩增并测序鉴定,EcoR I和BamH I双酶切后回收连接到酵母表达载体pGBWT- 7中并应用酵母双杂交系统3,构建MHBs诱饵质粒并转化酵母AH109,与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖苷酸上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠杆菌氨苄青霉素-LB平板上,选择并测序结果在GenBank中进行生物信息学分析。结果构建MHBs酵母细胞表达载体,配合后筛选出既能在四缺培养基(SD/-Trp-Leu-Ade-His)上培养也能在铺有X-α-半乳糖苷酸的四缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落2个,其中一个克隆为人醛缩酶B、另一个克隆为未知功能基因,新基因命名为MBP1。结论扩增出MHBs基因,用酵母双杂交技术筛选出2个与MHBs相互作用的肝细胞结合蛋白编码基因,为阐明MHBs的生物学功能及HBV损害肝细胞、致癌等方面的作用提供了新线索。     

弓形虫三磷酸核苷水解酶基因克隆、表达与鉴定

目的 对刚地弓形虫三磷酸核苷水解酶基因（NTPase）进行克隆、表达和鉴定。 方法 采用PCR扩增刚地弓形虫RH株的NTPase基因，克隆入pGEM?-T Easy载体，经酶切与测序鉴定后亚克隆至表达质粒pBAD-HisB，并转入大肠埃希菌(E.coli)BL21（DE3）中进行诱导表达。用镍-次氮基三乙酸亲和层析柱纯化重组质粒pBAD-HisB-NTPase表达产生的含组氨酸的重组蛋白，用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和蛋白质印迹（Western blotting）分析蛋白表达产物。 结果 PCR扩增得到特异的刚地弓形虫NTPase-Ⅱ基因序列，经测序鉴定无基因突变。SDS-PAGE结果表明NTPase-Ⅱ基因在E.coli BL21（DE3）中获得高效表达，其融合蛋白相对分子质量（Mr）约70 000，与理论值相近。Western blotting分析结果显示，纯化的重组蛋白可被弓形虫感染的鼠血清及鼠抗重组蛋白血清识别。 结论 所克隆表达的弓形虫NTPase-Ⅱ重组蛋白具有良好的抗原性。     

乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4基因剪切体HBeBP4A的克隆与原核表达

目的:克隆乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白未知功能新基因HBeBP4的剪切体基因HBeBP4A,构建其原核表达载体,诱导在大肠埃希菌中表达。方法:应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及生物信息学(bioinformat-ics)技术从HepG2细胞提取的cDNA模板中扩增获得HBeBP4基因的剪切体基因HBeBP4A,选用pGEM-T-easy载体进行TA克隆,通过PCR、限制性酶切分析及测序进行鉴定,再将其亚克隆到原核表达载体pET-32a( )中,转化进BL21(DE3)宿主菌,IPTG诱导HBeBP4A融合蛋白的表达,表达产物进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析,考马斯亮蓝染色,以抗-His的单克隆抗体进行Western blotting免疫印迹分析鉴定证实表达蛋白的特异性。结果:成功扩增出HBeBP4剪切体基因HBeBP4A,并将其插入pET-32a( )原核表达载体,经BL21(DE3)受体菌转化、IPTG诱导、SDS-PAGE分析获得了HBeBP4A重组蛋白的表达,Western blotting证实了重组蛋白表达的特异性。结论:发现了乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白4(HBeBP4)基因的剪切体HBeBP4A,构建了pET-32a( )-HBeBP4A原核表达载体,并利用大肠埃希菌原核表达系统成功获得了pET-32a( )-HBeBP4A重组蛋白的表达。     

恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ全编码区基因的真核克隆及表达

目的 探讨恶性疟原虫富组蛋白Ⅱ（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ－ｒｉｃｈ ｐｒｏｔｅｉｎⅡ,ＨＲＰⅡ）基因在真核细胞中的表达。方法 应用聚合酶链反应（ＰＣＲ）扩增ＨＲＰⅡ全编码区基因,经ＨｉｎｄⅢ和Ｂａｍ ＨＩ双酶切后定向克隆入带ＣＭＶ启动子的真核高效表达载体ｐｃＤＮＡ３,构建ＨＲＰⅡ／ｐｃＤＮＡ３重组载体;用脂质体法将重组载体转染ＨｅｐＧ２肝癌细胞,经Ｇ４１８加压筛选后,收集阳性克隆细胞培养上清,表达产物进     

丙型肝炎NS5ATP6基因原核表达载体的构建和表达纯化及多克隆抗体的制备

目的构建丙型肝炎病毒NS5A蛋白反式激活蛋白6基因的原核表达载体并进行表达、鉴定。方法从已构建的pGBKT7-NS5ATP6质粒上切取NS5ATP6基因,再克隆入pET32a( )质粒,构建pET32a( )-NS5ATP6表达重组体。结果以pET32a( )-NS5ATP6重组体分别转化DH5α和Rosseta大肠埃希菌后,经IPTG诱导,pET32a( )-NS5ATP6表达出分子量为41KD左右的重组蛋白。免疫动物并经Westernblot检测证实其具有良好的抗原性。结论成功地构建了原核表达载体pET32a( )-NS5ATP6,诱导表达和纯化了NS5ATP6融合蛋白,并制备了该蛋白的多克隆抗体,为下一步该基因功能研究奠定了基础。     

淡色库蚊细胞色素P450 CYP4E2r6基因的克隆、表达及鉴定

目的克隆并表达鉴定淡色库蚊细胞色素P450(CYP4E2r6)基因。方法根据昆虫细胞色素P450氨基酸保守序列设计一对简并引物，采用RT—PCR，从淡色库蚊四龄幼虫mRNA中扩增出目的基因片段。产物经T—A克隆、测序、比对，在抗性品系高表达的CYP4E2r6亚克隆入原核表达载体pGEX-6P1，在大肠杆菌BL21中进行原核表达。将细菌总蛋白进行SDS-PAGE及Western blot鉴定。结果14个阳性克隆中9个为CYP4新序列，由GenBank登录上网(GenBank／NCBI CB074944—51、CB270837，2003年)；经鉴定属CYP4家族CYP4H、CYP4E、CYP4J亚家族；CYP4E2r6基因已成功表达。结论获得的CYP4E2r6融合表达蛋白为进一步研究CYP4基因与抗药性之间的关系奠定基础。     

乙型肝炎病毒前S1蛋白反式调节基因2的克隆、表达及功能

目的 应用原核表达系统表达HBV前S1蛋白反式调节基因2(PS1TP2),酵母双杂交技术筛选白细胞文库中与之结合的蛋白质,了解该基因产物在肝癌细胞系中的亚细胞定位.方法 应用生物信息学初步探讨PS1TP2结构及功能.PCR扩增PS1TP2基因,构建pET32a(+)-PS1TP2表达载体,在大肠埃希菌Rosettap中进行诱导表达.构建pGBKT7-PS1TP2重组载体,应用酵母双杂交技术,在营养缺陷型培养基上筛选白细胞cDNA文库中与之结合的蛋白质.构建pEGFP-C1-PS1TP2表达质粒,转染肝癌细胞株HepG2,利用荧光显微镜和共聚焦显微镜观察PS1TP2的亚细胞分布.结果 PS1TP2基因位于6q24.1,疏水指数较高.PS1TP2能在原核系统中表达,表达产物相对分子质量约4.1×104.酵母双杂交技术筛选出白细胞cDNA文库中与之结合的蛋白质26个.PS1TP2亚细胞定位于细胞质中.结论 在原核表达系统中成功表达了PS1TP2,为抗体的制备奠定了基础.PS1TP2可与白细胞表达的某些蛋白质相互作用,在肝癌细胞系中定位于细胞质,为进一步探究HBV感染的发病机制提供了新线索.     

细粒棘球绦虫亲环蛋白基因的克隆 重组表达和生物信息学分析

目的 克隆表达细粒棘球绦虫亲环蛋白 （EgCyP） 基因, 并对其进行生物信息学分析。方法 从细粒棘球绦虫cD? NA中扩增目的基因, 克隆入表达载体pET28a, 转化大肠埃希菌 （E.coli） BL21 （DE3）, 经异丙基?β?D硫代半乳糖苷诱导表达后, 进行SDS?PAGE和免疫印迹试验鉴定, 并对其进行生物信息学分析。 结果 重组质粒pET28a?EgCyP构建成功。SDS? PAGE和免疫印迹试验结果显示, 重组蛋白在E.coli BL21 （DE3） 中获得高效表达, 重组蛋白EgCyP分子量约为22 kDa, 可被细粒棘球绦虫感染犬血清识别。生物信息学分析显示该蛋白具有7个潜在的抗原表位。 结论 成功克隆出细粒棘球绦虫EgCyP基因并在E.coli BL21 （DE3） 中表达, 为进一步研究其免疫原性奠定了基础。