内质网应激相关蛋白在阿霉素诱导的急性心肌损伤中的表达及意义

目的探讨内质网应激(ERS)相关葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和增强子结合蛋白环磷酸腺苷反应元件结合转录因子同源蛋白(CHOP)在阿霉素诱导的急性心肌损伤中的表达及意义。方法将8~10周雄性野生型C57BL/6J小鼠随机分为对照组与阿霉素组,每组20只,阿霉素组小鼠腹腔注射大剂量阿霉素(20mg/kg)诱导急性心肌损伤模型,对照组小鼠给予腹腔注射等量生理盐水。检测2组小鼠LVEF以及左心室短轴缩短率(LVFS)等心功能指标,记录体质量、心质量,心肌组织行苏木精-伊红染色。采用Real time-PCR和Western blotting法检测小鼠心肌组织GRP78、CHOP、Bax及Bcl-2mRNA和蛋白表达。结果与对照组相比,阿霉素组小鼠体质量、心脏质量、LVEF及LVFS明显降低,差异有统计学意义[(19.92±0.80)g vs(24.34±1.29)g,(96.58±8.37)mg vs(122.37±6.72)mg,(68.67±3.39)%vs(84.20±2.91)%,(27.10±1.24)%vs(39.96±3.53)%,P0.01]。组织病理结果显示阿霉素组小鼠心肌细胞排列紊乱,细胞质空泡化,心肌纤维扭曲,断裂。与对照组比较,阿霉素组小鼠心肌组织中GRP78、CHOP及Bax表达明显上调(P0.05),Bcl-2表达明显降低(P0.05),Bax/Bcl-2显著升高(P0.05)。结论 ERS可能通过调控心肌细胞凋亡,参与阿霉素诱导的急性心肌损伤过程。     

川芎嗪通过激活Akt/eNOS通路预防阿霉素致小鼠心脏毒性

目的研究川芎嗪对阿霉素诱导的小鼠心脏毒性的预防作用及其机制。方法建立阿霉素诱导的心脏毒性小鼠模型,将小鼠随机分为3组:对照组、阿霉素组(阿霉素15 mg/kg)、川芎嗪组[川芎嗪60 mg/(kg·d)+阿霉素15 mg/kg],心脏超声检测川芎嗪干预后阿霉素对小鼠心脏功能的影响,HE染色及Masson三色染色检测小鼠心脏组织学及胶原蛋白的变化,TUNEL染色检测小鼠心肌细胞凋亡情况,Western blot检测p-Akt、Akt、p-eNOS、eNOS及cleaved Caspase-3蛋白的表达。结果与阿霉素组相比,川芎嗪组左心室短轴缩短率(FS)和左心室射血分数(EF)显著升高(P0.01);川芎嗪显著降低小鼠心肌细胞凋亡(P0.01),明显抑制小鼠心肌纤维化和炎症细胞浸润(P0.01);与阿霉素组相比,川芎嗪组显著上调p-Akt和p-eNOS的表达(P0.05),显著下调cleaved Caspase-3的表达(P0.01)。结论川芎嗪通过激活Akt/eNOS通路抑制心肌细胞凋亡保护阿霉素诱导损伤心肌可能是川芎嗪预防阿霉素致心脏毒性的一个潜在机制。     

Parkin介导的线粒体自噬在高糖高脂导致的心肌细胞损伤中的保护作用

目的 明确Parkin（一种E3泛素化连接酶）介导的线粒体自噬对高糖高脂导致的原代心肌细胞损伤的保护作用。 方法 以LV-lacZ（LacZ空病毒）或LV-Parkin（Parkin过表达慢病毒）转染SD大鼠原代心肌细胞48 h,再用含葡萄糖（5.5 mmol/L NG）的培养基或含棕榈酸盐（500 μmol/L HF）和葡萄糖（25 mmol/L HG）的高糖高脂培养基培养心肌细胞24 h。 实验分组:①阴性对照组（NG-LacZ）,②正常Parkin过表达组（NG-Parkin）,③高糖高脂阴性对照组（HG-HF-LacZ）,④高糖高脂Parkin过表达组（HG-HF-Parkin）。用Western blot法检测PTEN介导的假定激酶蛋白1（PINK1）、Parkin、P62（一种自噬相关蛋白）、微管相关蛋白1轻链3（LC3）蛋白表达水平。采用JC-1染色法检测活细胞内线粒体膜电位水平。免疫荧光法检测自噬体数量,TUNEL法检测细胞凋亡率。 结果 与对照组相比,高糖高脂处理的原代心肌细胞自噬相关蛋白LC3-Ⅱ,P62表达水平上调（P<0.05）,PINK1表达未发生统计学差异,Parkin表达水平下调（P<0.05）,自噬体数量增多,线粒体膜电位下降功能损伤,心肌细胞凋亡率升高（P<0.05）。而用高糖高脂处理LV-Parkin转染的心肌细胞,LC3-Ⅱ蛋白表达水平进一步升高（P<0.05）,而P62表达水平显著下降（P<0.05）,自噬体数量进一步增多,细胞内线粒体膜电位水平上升,心肌细胞凋亡率下降（P<0.05）。 结论 高糖高脂可引起SD大鼠原代心肌细胞自噬流量降低,自噬小体增多,线粒体自噬发生障碍。Parkin过表达慢病毒通过激活心肌细胞内线粒体自噬途径,提高自噬流量,改善线粒体功能,降低心肌细胞凋亡率。     

左西孟旦对猪冠状动脉微栓塞后心肌细胞凋亡的影响

目的探讨左西孟旦对猪急性冠状动脉微栓塞(coronary microembolization,CME)后心肌细胞凋亡的影响及意义。方法健康巴马系小型猪15只,随机分为假手术组,CME组及干预组[0.05μg/(kg·min)左西孟旦预处理24h],每组5只。成功建立CME术后12h采用心脏超声检测心功能,TUNEL染色检测心肌细胞凋亡,Western blot检测活化半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达水平。结果与假手术组比较,CME组LVEF[(49.82±4.23)%vs(66.72±3.22)%]、左心室短轴缩短率及心排血量下降,左心室舒张末内径增加[(39.26±1.28)mmvs(32.38±1.58)mm,P0.05];与CME组比较,干预组心功能明显改善(P0.05)。与假手术组比较,CME组心肌细胞凋亡率[(10.558±2.425)%vs(0.242±0.070)%]、活化Caspase-3表达显著增加(P0.05);与CME组比较,干预组心肌细胞凋亡率[(6.820±1.974)%vs(10.558±2.425)%]、活化Caspase-3表达明显减少,差异有统计学意义(P0.05)。结论左西孟旦预处理可明显减少CME后心肌细胞凋亡,改善心功能。其机制可能是抑制心肌细胞促凋亡蛋白Caspase-3表达来实现的。     

瞬时受体电位通道A1在压力负荷致心肌肥厚小鼠的表达及意义

目的探讨瞬时受体电位通道A1(TRPA1)在压力负荷致心肌肥厚小鼠心肌组织中的表达及意义。方法选择SPF级雄性小鼠32只,随机分为假手术组和模型组,每组各16只。2组于第4周行超声检测,包括左心室收缩末期内径(LVESD)、左心室舒张末期内径(LVEDD)、LVEF以及左心室短轴缩短率(LVFS)。处死小鼠测量心脏质量和体质量,常规心肌组织苏木精伊红染色和麦胚凝集素染色。RT-PCR检测小鼠心肌组织心房钠尿肽(ANP)、心肌肌球蛋白重链β(β-MHC)和TRPA1mRNA表达,Western blot检测小鼠心肌组织磷酸化钙调蛋白依赖性的蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、总CaMKⅡ和TRPA1蛋白表达。结果模型组小鼠心脏质量、LVESD和LVEDD明显高于假手术组,LVEF和LVFS明显低于假手术组(P0.05)。模型组小鼠心肌细胞横截面积明显高于假手术组[(389.4±46.3)μm2 vs(213.1±27.5)μm2,P0.05]。与假手术组比较,模型组小鼠心肌组织ANP、β-MHC和TRPA1mRNA表达明显上调(P0.01);模型组小鼠心肌组织磷酸化CaMKⅡ/总CaMKⅡ和TRPA1蛋白表达明显升高(P0.01)。结论 TRPA1参与致心肌肥厚的过程,其机制可能与Ca2+相关信号相关。     

N-乙酰半胱氨酸对非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠肝细胞线粒体自噬的影响

目的在非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠中探索N-乙酰半胱氨酸(NAC)对肝细胞线粒体自噬的影响。方法C57BL/J6小鼠分别给予16周的正常饮食、高脂高糖(HFCD)饮食和HFCD+NAC饮食。比较HE和Masson染色、ALT、AST、IL-1β、肝组织甘油三酯水平评价小鼠肝损伤。通过免疫荧光染色观察线粒体自噬。比较3组小鼠肝组织内线粒体自噬标志物在mRNA和蛋白水平的变化。结果HFCD组小鼠较对照组ALT[(24.9±2.12)比(176.7±44.32)U/L,P<0.05]、AST[(76.7±9.06)比(291.3±39.66)U/L,P<0.05]、IL-1β[(2.94±0.08)比(9.12±1.21),P<0.05]显著升高,HFCD+NAC组较HFCD组肝功能好转,IL-1β降低[(9.12±1.21)比(6.77±0.58)ng/L,P<0.05]。HFCD组小鼠肝组织内Parkin、PINK1表达降低,同时LC3B II/I比值降低,P62表达量增高。提示HFCD组小鼠肝细胞线粒体自噬水平降低。HFCD+NAC组较HFCD组线粒体自噬水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论NAC可能通过改善肝细胞线粒体自噬,进而减轻肝细胞炎症进展。     

虫草素对阿霉素诱导的急性心力衰竭的心脏保护作用及机制

目的探讨虫草素对阿霉素诱导心功能不全、炎性反应和心肌细胞凋亡的影响。方法将小鼠80只随机分为对照1组、虫草素1组、阿霉素1组、处理1组,每组20只。虫草素1组和处理1组给予虫草素,连续4周;阿霉素1组和处理1组一次性注射阿霉素,对照组注射等量生理盐水。给予阿霉素5d后检测心功能,取材进行分子生物学检测和病理学检测。将H9C2心肌细胞分为对照2组、虫草素2组,阿霉素2组、处理2组,分别给予磷酸盐缓冲液、虫草素、阿霉素刺激、阿霉素+虫草素处理,进行分子生物学和病理学检测。结果与对照1组比较,阿霉素1组和处理1组LVEF、左心室缩短率(LVFS)及Bcl-2蛋白表达水平明显下降(P0.05),白细胞介素(IL)1β、IL-6、TNF-αmRNA表达、CD45、磷酸化NF-κB抑制蛋白(P-IκB)α、磷酸化P65(P-P65)、半胱氨酸天冬氨酸酶-3(caspase-3)、Bax蛋白表达及凋亡的心肌细胞水平明显升高(P0.05)。但与阿霉素1组比较,处理1组LVEF、LVFS明显升高[(48.0±6.9)%vs (66.0±5.5)%,(26.0±5.7)%vs (37.0±6.1)%,P0.05],炎性因子(IL-1β、IL-6、TNF-α)mRNA表达、CD45、P-IκBα、P-P65、caspase-3、Bax蛋白表达及凋亡的心肌细胞明显降低(P0.05),Bcl-2蛋白表达水平明显升高(P0.05)。虫草素1组与对照1组各项指标比较,无统计学差异(P0.05)。与对照2组比较,阿霉素2组和处理2组IL-1β、IL-6和TNF-αmRNA表达及P-IκBα、P-P65蛋白表达明显升高(P0.05);与阿霉素2组,处理2组IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达及P-IκBα、P-P65蛋白表达明显下降(P0.05)。阿霉素2组显著诱导H9C2心肌细胞凋亡,处理2组心肌细胞凋亡情况明显改善。结论虫草素可以改善阿霉素诱导的心功能不全,通过抑制NF-κB信号通路降低阿霉素诱导的炎性反应和心肌细胞凋亡。     

褪黑素通过介导线粒体自噬改善糖尿病心肌梗死后心肌损伤

目的 探讨褪黑素通过介导线粒体自噬对糖尿病(DM)心肌梗死(MI)后心肌损伤的保护作用及相关机制。方法 将32只C57BL/6J雄性小鼠按照随机数表法随机分为4组,每组8只:(1)假手术组(sham组);(2)糖尿病组(DM组);(3)糖尿病急性心肌梗死组(DMI组);(4)糖尿病急性心肌梗死+褪黑素组(DMI+Mel组)。4周后行超声心动图检测小鼠心脏功能。取心脏行切片染色,检测小鼠心肌间质纤维化程度和心肌细胞凋亡水平。培养H9c2细胞,分为以下4组:(1)对照组(CON组);(2)高糖高脂组(HG/HF组);(3)高糖高脂缺氧组(HG/HF+hypoxia组);(4)HG/HF+hypoxia+Mel组。行相应处理后,采用蛋白质印迹法检测B细胞淋巴瘤-2蛋白(Bcl-2)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3蛋白(Caspase-3)、Bcl-2关联X蛋白(Bax)和微管相关蛋白1轻链3-β(LC3)、死骨片蛋白1(P62)、帕金蛋白(Parkin)等线粒体自噬相关蛋白的表达,采用荧光素酶法检测细胞内三磷酸腺苷(ATP)浓度。采用SPSS 25.0统计软件进行数据分析。根据数据类型,分别采用方差分析和Dunnett法进行组间比较。结果 与sham组相比,DMI组和DMI+Mel组小鼠的左心室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)显著降低;左室收缩末期内径(LVESD)、左室舒张末期内径(LVEDD)、心肌细胞横截面积、间质纤维化程度和细胞凋亡率显著升高,差异均有统计学意义(P＜0.05)。与DMI组相比,DMI+Mel组小鼠的心功能明显改善;LVESD、LVEDD、心肌细胞横截面积、间质纤维化程度和细胞凋亡率显著降低,差异均有统计学意义(P＜0.05)。与CON组相比,HG/HF组和HG/HF+hypoxia组细胞Bax、Caspase-3、P62表达显著升高,Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Parkin水平显著降低,细胞内ATP含量显著降低,差异均有统计学意义(P＜0.05)。与HG/HF组和HG/HF+hypoxia组相比,HG/HF+hypoxia+Mel组细胞Bax、Caspase-3、P62表达显著降低,Bcl-2、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Parkin水平显著升高,细胞内ATP含量显著升高,差异均有统计学意义(P＜0.05)。结论 褪黑素可通过增强线粒体自噬减轻糖尿病心肌梗死后心肌细胞的损伤,从而改善心脏功能。     

辛二酰苯胺异羟肟酸通过抑制组蛋白去乙酰化酶改善小鼠心肌肥厚的研究

目的:探讨组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)改善小鼠心肌肥厚的作用,为防治心肌肥厚提供新思路。方法:选取60只昆明小鼠,随机分为正常组、假手术组、心肌肥厚组、心肌肥厚+SAHA组,通过部分结扎小鼠胸主动脉建立心肌肥厚模型,最终每组纳入6只。采用苏木素伊红(HE)染色观察小鼠心肌细胞,超声心动图检测小鼠心功能,比色法检测HDAC活性,小鼠心肌组织中HDAC亚型HDAC5和β-肌球蛋白重链(β-MHC)信使核糖核酸(mRNA)和蛋白表达水平分别运用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)检测。结果:HE染色结果表明心肌肥厚组小鼠心肌细胞肥大、排列紊乱、细胞核深染。心肌肥厚组小鼠左心室舒张末期直径、左心室舒张末期容积均显著低于假手术组(P0.05),而室间隔明显较假手术组增厚(P0.05)。心肌肥厚组小鼠HDACs活性显著高于假手术组(P0.05);心肌肥厚组HDAC5和β-MHC的mRNA及蛋白表达水平均显著高于假手术组(P0.05)。SAHA能够显著降低HDAC5表达水平,显著下调心脏肥厚相关基因β-MHC的表达并改善小鼠心功能和心肌肥厚(P均0.05)。结论:HDAC参与了心肌肥厚的发生,HDAC抑制剂SAHA通过抑制HDAC5的表达从而改善小鼠心肌肥厚。     

长期高脂饮食对小鼠心肌组织自噬、凋亡及炎性反应的影响

目的:研究长期高脂饮食对小鼠心肌组织自噬、凋亡及炎性反应的影响。方法:6周龄雄性C57BL/6小鼠随机分为对照组和高脂喂养组,饲养至24周时,称量体质量,取小鼠心脏及附睾周围脂肪组织并称重,计算心脏质量/体质量比值;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应检测小鼠心肌组织自噬、心肌凋亡及炎性反应相关基因的mRNA和蛋白表达水平。结果:与对照组相比,高脂喂养组体质量、内脏脂肪和心脏组织质量均明显增加,心脏质量/体质量的比值也明显增加(P均0.05);小鼠心肌组织自噬标志基因LC3Ⅱ的mRNA和蛋白表达明显降低,自噬核心基因Becn1的mRNA和蛋白表达水平也明显降低(P均0.05);凋亡相关基因Bax和Bad的mRNA表达水平均明显升高,凋亡标志蛋白裂解型胱天蛋白酶-3(c-caspase-3)和裂解型多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(c-PARP)的蛋白表达水平均明显升高(P均0.05);炎性基因NLRP3、白细胞介素(IL)-1β和胱天蛋白酶-1(caspase-1)的mRNA表达水平均明显增加(P均0.05)。结论:长期高脂饮食抑制小鼠心肌组织自噬,增加心肌细胞凋亡和炎性反应相关基因的表达。