抗呆Ⅰ号对体外模拟脑缺血星形胶质细胞BDNF及bFGF动态变化影响的实验研究

目的 :本文用免疫组化的方法研究了体外缺氧缺糖模拟脑缺血再灌星形胶质细胞表达脑源形神经生长因子 (BDNF)及神经生长因子 (bFGF)的动态变化及抗呆Ⅰ号的干预作用。方法 :实验用出生 2～ 3d的大鼠的大脑皮层胶质细胞进行分离培养 ,建立缺氧缺糖星形胶质细胞损伤模型 ,实验分为正常对照组、模型组 (即缺氧缺糖组 )及抗呆Ⅰ号组。结果 :bFGF在各组均有表达 ,尤以缺血再灌组表达最强 ;BDNF在各组均仅有轻度表达。结论 :体外模拟脑缺血再灌后星形胶质细胞反应性胶质化 ,不同程度地表达BDNF和bFGF ,两者可降低星形胶质细胞本身的损伤 ,进而可能促进神经元的修复。     

天麻素对缺氧缺糖星形胶质细胞氧化损伤的影响

目的探讨天麻素对缺氧缺糖星形胶质细胞氧化损伤的影响。方法分离培养乳鼠星形胶质细胞,建立缺氧缺糖星形胶质细胞模型,同时在缺氧缺糖处理前给予天麻素预处理,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖,乳酸脱氢酶(LDH)检测试剂盒检测LDH的漏出率,流式细胞术检测细胞凋亡,Western印迹检测细胞中Bcl-2相关X蛋白(Bax)、活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平,JC-1法检测线粒体膜电位,Western印迹检测胞质中细胞色素(Cyt)C蛋白水平。结果缺氧缺糖处理后的星形胶质细胞中LDH漏出率显著升高,细胞增殖活性显著降低,细胞凋亡显著增多,细胞中Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平显著升高,细胞线粒体膜电位显著降低,胞质中CytC蛋白水平显著升高(均P0.05)。天麻素预处理后的缺氧缺糖星形胶质细胞增殖活性升高,细胞LDH漏出率显著降低,细胞凋亡显著减少,细胞中Bax、Cleaved Caspase-3、Cleaved Caspase-9蛋白水平显著下降,细胞线粒体膜电位显著升高,CytC蛋白水平显著降低,与未经天麻素处理的星形胶质细胞比较,差异有统计学意义(P0.05)。结论天麻素能降低缺氧缺糖星形胶质细胞氧化损伤,减少细胞凋亡。     

抑制MMP-9表达与大鼠氧糖剥夺后星形胶质细胞AQP4的表达变化

目的探讨抑制星形胶质细胞基质金属蛋白酶(MMP)-9表达与氧糖剥夺后水通道蛋白(AQP)4的表达变化。方法体外培养原代星形胶质细胞,建立氧糖剥夺缺血细胞模型,随机分为正常组、阴性对照组和MMP-9抑制组。应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法测定细胞存活率,利用慢病毒转染抑制MMP-9的表达,实时荧光定量RT-PCR验证MMP-9的表达,通过实时荧光定量RT-PCR和免疫印迹分别检测星形胶质细胞AQP4的表达变化。结果细胞经氧糖剥夺处理后,细胞存活率显著下降(P0.05);MMP-9抑制组星形胶质细胞与阴性对照组相比,MMP-9 mRNA表达显著下调(P0.05),AQP4 mRNA和蛋白表达均显著下降(P0.05)。结论氧糖剥夺使星形胶质细胞活性下降,抑制MMP-9的表达可介导AQP4表达下调,提示MMP-9和AQP4可能共同参与缺血性脑水肿的形成。     

U0126及地塞米松对氨培养SD乳鼠脑星形胶质细胞AQP4表达的影响

目的观察氨培养的脑星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)的表达,地塞米松及丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号转导通路抑制剂U0126对其表达的影响。方法分离、培养SD大鼠脑星形胶质细胞,分为氨培养组、氨培养+U0126组、氨培养+地塞米松组和正常对照组,采用免疫组织化学及逆转录聚合酶链式反应检测AQP4在蛋白和基因水平的表达和变化。结果氨可致培养的星形胶质细胞AQP4蛋白和AQP4 mRNA的表达增加。U0126和地塞米松均可使氨培养星形胶质细胞AQP4 mRNA和AQP4蛋白的表达减少。结论氨可致AQP4表达增加,U0126和地塞米松有细胞保护作用,可有效保护脑星形胶质细胞。     

高糖条件下腺苷酸活化蛋白激酶对大鼠胃平滑肌细胞能量代谢调控机制的研究

目的探讨高糖条件下腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)对大鼠胃平滑肌细胞能量代谢调控机制的影响。方法制备并确定糖尿病胃轻瘫(DGP)大鼠模型,实验分为正常对照(NC)组和DGP组,抗体芯片观察AMPK磷酸化通路的变化,确定能量代谢相关功能蛋白;SeahorseXFe细胞能量代谢分析系统观察2-脱氧-D-葡萄糖(2-DG)与化合物C(Compound C)对高糖条件下大鼠胃平滑肌细胞耗氧率(OCR)与细胞外酸化率(ECAR)的影响;沉默AMPK后,观察高糖条件下大鼠胃平滑肌细胞能量代谢相关功能蛋白变化。结果高糖条件下AMPK抑制大鼠胃平滑肌细胞OCR的基础呼吸、最大呼吸值、三磷酸腺苷产量(P<0.05),促进大鼠胃平滑肌细胞ECAR的糖酵解水平和能力(P<0.01)。抗体蛋白芯片发现18个磷酸化差异抗体,涉及与能量代谢相关蛋白包括:p53、Ca²⁺/CaM依赖性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)、Ca²⁺/CaM依赖性蛋白激酶Ⅳ(CaMKⅣ)、磷脂酰肌醇特异性磷酯酶C-β3(PLC-β3)、蛋白激酶A(PKA)、乙酰CoA羧化酶1(ACC1)、真核延伸因子2(eEF2)、真核延伸因子激酶2(eEF2K)。与HG(24 h)组比较,HG(48 h)组p53、ACC1、eEF2表达升高(P<0.05或P<0.01),PLC-β3表达降低(P<0.01)。与HG(48 h)组比较,HG(48 h)+siRNA组p53、ACC1表达降低(P<0.01)。与HG(24 h)组比较,HG(48 h)组p-CaMKⅡThr³⁰⁵/CaMKⅡ与p-CaMKⅣThr^196/200/CaMKⅣ比值升高(P<0.01)。与HG(48 h)组比较,HG(48 h)+siRNA组p-CaMKⅡThr³⁰⁵/CaMKⅡ比值降低(P<0.01)。HG(48 h)组PKA活性高于HG(24 h)组(P<0.01)。结论高糖条件下AMPK通过调控p53、ACC1、eEF2、CaMKⅡ、CaMKⅣ、PLC-β3及PKA生物学作用,抑制大鼠胃平滑肌细胞线粒体代谢途径及促进糖酵解途径。     

慢病毒转染基质金属蛋白酶9对星形胶质细胞水通道蛋白4表达的研究

目的观察慢病毒转染基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)后,星形胶质细胞水通道蛋白4(aquaporin,AQP4)表达变化,探讨慢病毒转染星形胶质细胞的可行性。方法取出生2d的SD乳鼠大脑皮质进行星形胶质细胞纯化培养,利用携带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因的慢病毒转染细胞,通过倒置荧光显微镜观察细胞内GFP显影效果。将细胞分为正常组、阴性对照组[转染小干扰RNA(siRNA)]和MMP-9慢病毒组(转染MMP-9siRNA),用RT-PCR检测MMP-9 mRNA和AQP4 mRNA表达变化。结果 MMP-9慢病毒组细胞增殖较快,第3天细胞内GFP在倒置荧光显微镜显影90%,到达80%左右转染率的最佳感染条件为复感染指数=30～50。正常组MMP-9mRNA和AQP4mRNA表达为0.982±0.169和1.095±0.035,阴性对照组分别为1.104±0.271,1.112±0.026,MMP-9慢病毒组表达分别为0.552±0.197和0.652±0.042。正常组与阴性对照组MMP-9mRNA和AQP4mRNA表达比较,差异无统计学意义(P0.05);与阴性对照组和正常组比较,MMP-9慢病毒组细胞MMP-9mRNA和AQP4mRNA表达明显下调,差异有统计学意义(P0.05)。结论慢病毒转染星形胶质细胞MMP-9可介导AQP4表达下调,为进一步利用星形胶质细胞进行缺血性脑水肿基因调节的研究提供实验依据。     

腺苷预处理星形胶质细胞氧糖剥夺复氧糖后CX3CL1、GLT-1表达的变化

目的探讨在缺氧复氧情况下腺苷预处理诱导星形胶质细胞谷氨酸转运体蛋白(GLT-1)和趋化因子(CX3CL1)的表达变化。方法原代培养的大鼠星形胶质细胞分为正常组、模型组和腺苷预处理组。模型组:细胞接受5 h氧糖剥夺/复氧糖24 h处理;腺苷预处理组:细胞在氧糖剥夺前24 h加入100μmol/L腺苷后接受5 h氧糖剥夺/复氧糖24 h。在5 h氧糖剥夺/复氧糖24 h后观察各组的细胞形态、MTT法检测各组细胞活力,ELISA检测各组CX3CL1的相对表达情况,免疫荧光法及Western印迹法检测各组GLT-1的相对表达情况。结果①正常组、模型组和腺苷预处理组在氧糖剥夺5 h复氧糖24 h后细胞活力(OD值)分别是(0.763±0.065),(0.217±0.052)和(0.404±0.013),腺苷可以减少缺氧复氧引起的损伤(P<0.05)。②与正常组相比,星形胶质细胞在缺氧复氧后,其释放的趋化因子CX3CL1明显升高(P<0.05),GLT-1的表达明显降低(P<0.05)。与模型组相比,腺苷预处理组可明显降低缺氧复氧组CX3CL1的释放(P<0.05),以及增加缺氧复氧GLT-1的表达水平(P<0.05)。结论腺苷预处理可使氧糖剥夺/复氧糖后CX3CL1的释放减少,GLT-1表达量升高,从而增强脑对缺血再灌注损伤的耐受。     

二甲双胍调节糖尿病大鼠心房小电导钙激活钾通道亚型蛋白表达的信号通路

目的探讨蛋白激酶A(PKA)/钙调蛋白Ⅱ(CaMKⅡ)信号通路在二甲双胍(Met)调节2型糖尿病(T2DM)大鼠心房小电导钙激活钾通道亚型KCa2.2和KCa2.3蛋白表达中的作用。方法健康雄性Wistar大鼠40只,随机选8只喂普通饲料为对照组(Con组),另32只喂高脂高糖饲料联合腹腔注射小剂量链脲佐菌素构建T2DM大鼠模型后,再随机分为DM组、Met组、H-89组(腹腔注射PKA抑制剂H-89)和KN-93组(腹腔注射CaMKⅡ抑制剂KN-93),每组8只。用ELISA检测大鼠心房组织PKA活性,qRT-PCR检测CaMKⅡmRNA表达,Western blot和免疫组织化学检测KCa2.2、KCa2.3和磷酸化CaMKⅡ(p-CaMKⅡ)蛋白表达。结果 Con组、DM组、Met组和H-89组PKA活性分别为0.74±0.04、0.50±0.05、0.69±0.03和0.48±0.03。与DM组比较,Met组PKA活性明显提升(P<0.01);与Met组比较,H-89组显著抑制PKA活性(P<0.01)。Con组、DM组及Met组CaMKⅡmRNA分别为1.00±0.07、0.61±0.03和0.92±0.09。与Con组比较,DM组CaMKⅡmRNA表达明显降低(P<0.01);与DM组比较,Met组CaMKⅡmRNA表达明显增加(P<0.01)。与Con组比较,DM组心房组织p-CaMKⅡ和KCa2.2蛋白表达均明显降低,KCa2.3蛋白表达明显升高(P<0.01)。与DM组比较,Met组明显提升p-CaMKⅡ和KCa2.2蛋白表达,明显抑制KCa2.3蛋白表达(P<0.01)。与Met组比较,KN-93组和H-89组分别显著抑制p-CaMKⅡ蛋白表达和PKA活性,均显著下调KCa2.2蛋白表达,上调KCa2.3蛋白表达(P<0.01)。免疫组织化学染色显示,与Met组比较,KN-93组和H-89组均显著下调KCa2.2蛋白表达,上调KCa2.3蛋白表达(P<0.05,P<0.01),与Western blot检测结果一致。结论 Met通过激活PKA/CaMKⅡ信号通路部分修复T2DM大鼠心房KCa2.2蛋白下调和KCa2.3蛋白上调。     

小RAN干扰Trx1促进大鼠缺血再灌注损伤的星形胶质细胞凋亡、抑制其增殖及作用机制

目的研究硫氧还蛋白(Trx)1在氧糖剥夺(OGD)损伤后对星形胶质细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制。方法将体外培养原代星形胶质细胞分为对照组、OGD模型组、小干扰(si)RNA-NC组、siRNA-Trx1组,采用携带Trx1的siRNA星形胶质细胞抑制Trx1表达后进行OGD/复氧(R)干预,氧糖剥夺6 h,复氧24 h,对照组为正常培养的星形胶质细胞。实时荧光定量PCR(qPCR)检测干扰效果。噻唑蓝(MTT)实验检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,免疫印迹试验检测含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-3、活化的(Cleaved)Caspase-3、B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)水平。结果与对照组相比,OGD模型组、siRNA-NC组、siRNA-Trx1组Trx1 mRNA表达水平显著增加(P0.05),Bcl-2蛋白显著下降(P0.05),Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平显著增加(P0.05);与OGD模型组相比,siRNA-NC组星形胶质细胞的增殖、凋亡及凋亡蛋白水平无显著变化(P0.05),siRNA-Trx1组细胞的增殖显著降低(P0.05),凋亡显著增加(P0.05),Bcl-2蛋白水平显著降低(P0.05),Cleaved Caspase-3、Bax蛋白水平显著增加(P0.05)。结论 Trx1可促进氧糖剥夺损伤的星形胶质细胞增殖、抑制其凋亡,其作用机制可能与调控Bcl-2/Bax/Cleaved Caspase-3信号通路有关。     

窖蛋白1对大鼠星形胶质细胞糖氧剥夺损伤的影响

目的探讨糖氧剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)对体外培养的大鼠星形胶质细胞窖蛋白1(caveolin-1,Cav-1)的影响。方法原代培养出生24h内SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞,分为对照组和OGD组(给予星形胶质细胞6h的OGD和24h的再灌注损伤,建立OGD损伤模型)。用多重免疫荧光的方法检测星形胶质细胞Cav-1表达,实时荧光定量PCR和Western blot的方法检测星形胶质细胞Cav-1表达的变化。根据小干扰RNA(siRNA)的原理,将Cav-1siRNA转染星形胶质细胞,采用CCK-8的方法检测星形胶质细胞活力。结果大鼠大脑皮质星形胶质细胞Cav-1普遍表达。与对照组比较,OGD组星形胶质细胞Cav-1mRNA和蛋白表达量下降(P<0.05)。siRNA转染后,与对照组比较,OGD组星形胶质细胞活力下降(P<0.05)。结论 SD大鼠大脑皮质星形胶质细胞Cav-1表达的下调,导致OGD后细胞损伤加重,提示Cav-1对星形胶质细胞具有保护作用。